Ion Torrent 데이터는 어떻게 사용해야 할까?

S5 데이터를 생각보다 많이 만지고 있어서 간만에 S5의 데이터에서 주의해야하는 것들에 대한 논문한번 뒤적거려보았습니다.

2013년도에 나온 "Shining a Light on Dark Sequencing: Characterising Errors in Ion Torrent PGM Data" 으로 Ion Torrent의 PGM에서 발생 할 수 있는 문제들을 훑어본 논문으로 생각되어 읽어보았습니다.

DOI: 10.1371/journal.pcbi.1003031

음... 귀찮으니 일단 Copilot (with Bing Chat)에게 논문을 읽고 블로그용 컨텐트를 작성하는데 어떤 것들을 주의해야하는지에 대해서 작성해 달라고 하였습니다.

PGM이라는 시퀀싱 기계는 Ion Torrent의 제품으로, DNA를 분석하기 위해 반도체 칩을 사용하는 방식입니다. 이 방식은 다른 시퀀싱 기술에 비해 빠르고 저렴하게 데이터를 생성할 수 있는 장점이 있습니다. 하지만, PGM에서 발생할 수 있는 error에 대해서 주의해야 합니다.

PGM에서 생성되는 데이터는 다음과 같은 error를 포함할 수 있습니다.

- **Homopolymer error**: 연속된 동일한 염기가 있는 경우, 정확한 염기 수를 측정하기 어려운 error입니다. 예를 들어, AAAAA라는 염기가 있으면, PGM은 이것을 AAAA나 AAAAAA로 인식할 수 있습니다. 이러한 error는 PGM의 시그널 강도가 염기 수와 선형적으로 증가하지 않기 때문에 발생합니다.

- **GC bias**: GC 함량이 높거나 낮은 영역에서 시퀀싱 효율이 떨어지는 현상입니다. PGM은 GC 함량이 40% 이상인 영역에서 시퀀싱 효율이 감소하고, GC 함량이 60% 이상인 영역에서는 거의 시퀀싱되지 않습니다. 이러한 bias는 PGM의 PCR 과정에서 발생합니다.

- **Over- and under-sampling**: PGM에서는 반도체 칩에 DNA 분자를 고르게 분배하기 어렵습니다. 따라서 일부 영역은 다른 영역보다 많이 또는 적게 시퀀싱될 수 있습니다. 이러한 sampling bias는 PGM의 emulsion PCR 과정에서 발생합니다.

PGM 기계에서 생성되는 데이터를 사용할 때 주의해야 하는 것은 다음과 같습니다.

- **Error rate 확인**: PGM 데이터는 homopolymer error로 인해 다른 시퀀싱 데이터보다 error rate가 높을 수 있습니다. 따라서 PGM 데이터를 사용할 때에는 error rate를 확인하고, 필요한 경우 error correction을 수행해야 합니다.

- **GC bias 보정**: PGM 데이터는 GC bias로 인해 특정 영역의 시퀀싱 깊이가 왜곡될 수 있습니다. 따라서 PGM 데이터를 사용할 때에는 GC bias를 보정하거나, GC bias에 민감하지 않은 분석 방법을 사용해야 합니다.

- **Sampling depth 고려**: PGM 데이터는 over- and under-sampling으로 인해 일부 영역의 시퀀싱 깊이가 다른 영역보다 많이 또는 적게 될 수 있습니다. 따라서 PGM 데이터를 사용할 때에는 sampling depth를 고려하고, 필요한 경우 rarefaction을 수행해야 합니다.

PGM 기계는 혁신적인 시퀀싱 기술이지만, 그만큼 error와 bias에 주의해야 합니다. 이러한 문제점을 인식하고, 적절한 보정과 분석 방법을 사용한다면, PGM 데이터로부터 유용한 정보를 얻을 수 있을 것입니다.

제법... 괜찮습니다. 

Homopolymer 에러를 비롯해서 GC bias 에 대한 얘기도 해주고, 고르게 시퀀싱이 되지 않으니 read sampling에 대한 얘기도 함께 얘기해주었습니다. 제가 읽었으면 아마 Error rate 내용만 편향적으로 보고 "저거봐라 왜 Ion 쓰냐"라고 말을 줄이지 않았을까 합니다.

물론... 비정상적으로 긴 homopolymer 변이가 있는 종에 대해서는 도전정신을 가지고 Ion 시퀀서를 써봤자 너님만 손해다가 오늘의 한줄 요약 되겠습니다.

출처: ye._.vely618

Application of Next Generation Sequencing in Laboratory Medicine

임상검사실? 진단검사의학?에서의 NGS 활용에 대한 논문으로 사실 작년 2022년 LMCE 발표 준비하면서 잠시 훑어본 내용인데 NGS를 임삼검사실에서 어떻게 활용할 수 있을지에 대해서 이런저런 내용들을 얘기하고 있어서 가져와봤습니다.

2021년 1월달에 출판되었고 제목은 Application of Next Generation Sequencing in Laboratory Medicine이고
DOI: 10.3343/alm.2021.41.1.25 입니다. 

NGS는 기존 1세대시퀀싱에 비해 1bp 염기서열 단위의 해상도로 대규모의 정보를 한번에 분석할 수 있는 기술이죠.  그래서 다음과 같이 암 환자, 유전질환 환자 또는 감염병 환자로 부터 얻어진 시료를 시퀀싱하여 

- 암 환자의 경우, 암의 유형과 치료 반응을 예측 할 수 있고,

- 유전 질환 환자의 경우, 염기서열 또는 유전체 구조적인 이상을 확인하여 질환의 원인 확인 할 수 있고,

- 감염병 환자의 경우, 감염균의 종류와 기존 약제에 대해서 내성을 가지고 있는지 여부 등을 알 수 있습니다.

진단이라는 분야에서는 혁신적이거나 혁명적인지는 언급하기 어렵겠지만 염기서열을 해독하는 시퀀싱이라는 분야에서는 NGS는 단연코 혁신 기술이긴 하죠. 그래서 FDA도 NGS 기반의 진단과 함께 처방하는 치료제(동반진단)에 대해서 승인하기도 하고 있죠. 많은 실험실에서 RWD를 기반으로 NGS 테스트를 더 넓게 활용 할 수 있도록 위해 노력하고 있으니 조만간 더 많은 분야에 사용되지 않을까합니다.

2세대 NGS는 단점이라고 한다면 짧은 read 였는데, 긴 길이의 read를 시퀀싱 할 수 있는 3세대 시퀀싱을 더 다양하게 활용할 수 있고, 실험 방법이나 장비가 고가이며 숙련된 연구원들만 가능한데, 이 부분이 해소되면 더 많은 분야에서 활용 할 수 있을 듯 합니다.

출처 : @ye._.vely618

이제 우리 cfDNA를 활용해 보아요 (feat. 머신러닝)

Genome-wide cell-free DNA fragmentation in patients with cancer

"내 혈관 속 DNA가 말해줘"라는 BTS의 DNA의 가사 처럼 우리 혈관 속에는 우리 상태를 알게 해주는 마커로 사용할 수 있는 cfDNA가 있습죠

오늘은 2019년 발표된 "Genome-wide cell-free DNA fragmentation in patients with cancer"라는 논문을 가져와봤습니다.

DOI: 10.1038/s41586-019-1272-6

이 논문은 암환자의 혈액 내 cfDNA를 측정하여 암 진단은 당연하고, 어떤 암종인지, 조기 발견 및 모니터링을 위한 초석을 놓은... 물론 그전에 다른 논문에서 이미 초석을 다진 논문도 있을것 같긴하지만, 어찌됐든 모 괜찮은 논문이라고 생각합니다. :)

그래서 7종의 암환자 200여명과 건강한 (aka 암환자가 아닌) 건강한 사람의 cfDNA을 분석해서 이리저리 굴려보고 돌려보고 해서(결국 머신러닝 아니겠습니까) 암종간 cfDNA의 profile의 변화를 머신러닝을 통해 모델을 만들었고, cfDNA profile 모델과 함께 cfDNA상에 존재하는 변이를 활용하면 더 나은 결과를 보여줬다고 하네요

cfDNA는 원래 혈액속에 있는 암에 걸리면 (무조건은 아니지만) cfDNA의 양이 증가하게 됩니다. 원래 혈액속에 떠다니는 cfDNA가 만들어지는 source외에 암세포가 혈액에 추가로 cfDNA가 더 공급하는 꼴이 되기때문이죠.

cfDNA 중 암세포에서 나온 cfDNA인 ctDNA?만 따로 선별하는 방법으로 접근하기도합니다. 개인적으로는 cfDNA에서 ctDNA를 찾겠다 보다는  cfDNA를 더 잘 characterization 하는게 나을듯한데... cfDNA를 characterization하면 ctDNA를 더 잘 구별할 수 있게 되는건가? 여튼..

아.. 그래서 제가 블로그에 가끔씩 얘기했던 NIPT를 하다가 산모의 암도 찾아냈다고 하는 얘기가 있었기도 했습니다.

오늘은 cfDNA와 머신러닝 방법을 이용해서 암진단 및 암종 구분을 하는 논문에 대해서 잠깐 얘기해보았는데, 분야를 막론하고 머신러닝 모델을 개발할것 까지는 아니지만 활용을 잘 할 수 는 있어야 한다는 느낌은 항상 받는것 같습니다.

23년 12월의 첫날, 아내느님의 탄생일 기념으로 포스팅을 해보았습니다.

출처 : @candyz_hyojung

어떤 시퀀서가 NIPT를 잘 할까

간만에 NIPT 논문을 들고 와봤습니다.

어떤 시퀀서가 NIPT에 더 적합한가 알아보자 되겠습니다.

2019년에 출판된 논문으로 "Prospective head-to-head comparison of accuracy of two sequencing platforms for screening for fetal aneuploidy by cell-free DNA: the PEGASUS study" 이고, 

doi는 https://doi.org/10.1038/s41431-019-0443-0 입니다.

위에서 언급했다 싶이 시퀀싱 기기별 NIPT의 임상적 성능을 비교한 내용으로 T13/18/21 그리고 Monosomy X 검사에 대해서 테스트를 진행했다고 합니다.

그리고 비교한 시퀀싱 기기는 시퀀싱 시장의 대장인 illumina의 HiSeq와 Thermo의 Proton이라고 하네요.

결과적으로는 둘다 정확도는 99%이상이었으나 미세하게 차이가 결과에 차이가 있었다고합니다. 

민감도와 위양성률 모두 HiSeq 성능이 우수했고, 시퀀싱 처리시간에서는 Proton이 짧은 처리 시간을 자랑한다고 합니다.

표면적으로 보면 일루미나의 HiSeq이 Thermo의 Proton보다 우수하다고 결정 내릴 수 있으나 사실 꼭 그렇지는 않을듯합니다. 실험 디자인에서 서술되어 있는 내용을 보면 cell-free DNA 추출 후 두개로 나누어 각각 기기에서 실험을 한건 같아 보이지 않아서 입니다. 

혈액 채취 후 각각의 실험실에 보내어 각 실험실에서 자체 프로토콜로 진행하지 않았나 싶습니다. 그래서 정확하게는 실험실간의 성능 비교이지 않나 싶습니다.

NIPT에서는 cell-free DNA내 태아의 cell-free DNA 양이 굉장히 중요하기 때문에 실험을 하는 사람의 숙련도나 방법에 따라 분석을 할 수 없기도 해서..

여튼 그래도 중국에서 진행했던 (대략 1만여건 정도..) 대규모 연구 이후로 꽤 큰 샘플 개수이고 보통 단일 플랫폼으로 테스트를 진행하는데 서로 다른 기술 기반의 플랫폼(광학과 수소이온)에서 테스트를 하여 플랫폼 간 우위에 대한 내용은 얘기하기 어렵지만, 어찌 됐던 cell-free DNA 기반의 선별 검사는 효과적인 방법이라는 것을 다시 한번 확인하는 연구이지 않았나 싶네요

결론은 illumina던 Thermo던 압도적 우위에 있는 플랫폼은 없으니 각자 application과 상황에 맞는 플랫폼과 방법을 선택해서 하는 것이 중요하다. 정도? 이지 않나 싶네요 :)

아.. 연구 이름인 PEGASUS는 "PErsonalized Genomics for prenatal Aneuploidy Screening USing maternal blood"의 약자라고 합니다. PEGASUS 홈페이지도 있습니다.

출처: @ye._.vely618

NGS을 임상에 사용하기 위한, 5년의 시간

최근에 임상실험실에서 NGS 서비스를 시작한다고 하는 내용들의 뉴스..
를 신기하게 보시는 분들도 물론 있으실겁니다.

그러나 전공자나 업계에 몸 담고 있는 분들에게는 그리 신기하지 않은.. "아.. 어디 임상실험실에서 NGS 서비스를 하는구나" 정도로.. 어느 실험실에서 NGS로 검사를 해준다라고.. 정도의 수준일겁니다.

하지만 10년전만해도 NGS가 무슨 임상실험실에서 검사 서비스로 가당키나 한 분석 방법이냐고 하시는 분들이 대다수였을 때에 5여년동안 데이터를 쌓아서 NGS 플랫폼의 타당성을 입증한 논문이 있어 한번 가져와봤습니다.

Next generation sequencing for clinical diagnostics: Five year experience of an academic laboratory

DOI: 10.1016/j.ymgmr.2019.100464

태평양 건너 있는 미국 미네소타 대학교의 임상 실험실에서 2012년부터 2017년 동안, 자그마치 5년동안 NGS로 임상 진단 검사를 실시했던 데이터를 차곡 차곡 잘 수집/축적하여 공개한 내용으로 

2012년 8월부터 2014년 3월 까지는 568 유전자 영역의 SureSelect 패널을,

2014년 4월 부터 2017년 9월 까지는 일루미나의 TruSightOne 패널을,

2017년 10월부터 2017년 12월 까지는 TruSightOne 확장 패널을 사용하여

각각 349개, 2058개, 102개 검체, 모두 2059건의 검사를 실시했다고 하네요

전반적으로 25% 진단율을 유지하였다고 하고, 불확실한 의미 변이인 VUS 수가 2012년도에는 75%정도였는데 2017년도에서는 50%정도로 감소되었다고 합니다. 사실 지금 다시 하면 25%정도로 더 감소되어있지 않을까 하는 생각도 드네요. 

그리고 다양한 질병들에 대해서 진단을 하였는데 질병마다 진단율의 차이를 보였고, 피부병이나 청력손실, 안과질환 같은 경우에는 진단율이 40% 이상의 높은 진단율이, 소화기나 호흡기 질환의 진단율은 10%로 낮았다고 하는데 사실 이건 유전적 원인과 관계가 있냐없냐가 더 중요한 요인으로 보이네요.

결과적으로 이 연구 결과, 5년동안 2천개 넘는 검체를 검사해봤는데 NGS가 임상진단에 사용할 수 있는 유용성을 입증하였다고 생각되고, NGS가 임상 진단 부문에서 사용 할 수 있는 가시적은 근거자료로 활용되어 병원관리자들이 NGS 인프라에 투가하도록 설득 할 수 있는 자료로 사용 할 수 있다고... ??

그거까지는 난 모르겠고, 이전의 많은 연구진들의 연구 결과로 말미암아 이제는 NGS 검사가 우리 생활에 생각보다 많이 사용되고 있다는 것은 맞는 얘기인것 같습니다.

이전에 연구진들의 노고가 아니었다면 아직도 연구수준에서 벗어나지 못했을것 같습니다.

가끔 이런 논문들을  한번 들춰보는것도 나쁘지는 않아서 한번씩 꺼내볼 생각입니다.

출처: @ye._.vely618

Long Read Sequencing을 전적으로 믿으셔야 합니다.

항상 느끼는것이지만 사람들은 익숙한것에 익숙하다는...
물론 이 글을 쓰는 본인도 별반 차이 없다는게 현실
그럼에도 불구하고 세상에는 익숙한것을 거부하고 한 걸음 나아가는 분들이 있어서 발전한다는...

오늘은 유전체분야에서 다들 익숙한 짧은길이의 시퀀싱 플랫폼 대신 Long read 시퀀싱 플랫폼을 왜 써야하는지 보여주는 논문이 있어 들고와봤습니다.

The blooming of long-read sequencing reforms biomedical research

DOI: 10.1186/s13059-022-02604-2


Long read 시퀀싱의 대표주자인 PacBio와 Nanopore가 나온지도 꽤 된것 같으나, 아직 주류 시퀀싱 플랫폼으로서는 자리매김을 하지 못한... 조명받지 못하고 있지만.. 그 진가를 하나둘씩 알게되고 안쓸수 없지 않을까 합니다.

물론 이 Long read 플랫폼을 안 쓸수 없지만 PacBio/Nanopore 플랫폼을 이용해서 진단 키트를 개발하여 돈을 벌 수 있게 된다는 것은 아닙니다. 오해 없으시기 바랍니다. Long read 플랫폼에서 기존 NGS 시스템에서 해온 것 같이 하려고 하면 개인적인 생각으로는 그냥 하지 마세요 라고 말하고 싶네요. 그런 생각이라면..

여튼 Long read 플랫폼은 genome assembly과 transcriptome 분야에서 활약을 하고 있다고 하는데 이는 기존 NGS의 짧은 read로 인한 한계를 극복하였기 때문에 가능한 당연한 결과였을 듯 합니다.

genome assembly를 설명하면서 이런 저런 설명을 하였는데 사실 T2T genome이 세상에 나왔는데 무슨 설명이 더 필요할지... 물론 다배체면서, repeat 서열이 엄청 긴 식물과 같은 다양한 생물의 유전체 연구에서는 아직 할일이 많이 남아있을듯 합니다.

그리고 더불어 transcriptome, 전사체에서도 두각을 나타내고 있다고 합니다. 이전에 PcaBio사에서 나온 Iso-Seq이라는 플랫폼이 있었는데 기존 숏리드 플랫폼으로는 할 수 없었던 full-length 유전자 서열을 확인하여, 다양한 gene의 isoform 을 확인 할 수 있었는데, 이제는 이는 당연한것이고, read count를 활용하여 정확한 발현 측정까지도.. 가능하다고 합니다. 또한 이 논문에서 처음 보았는데 exitron이라는 것도 확인하였다고 하네요.

더불어 당연히 암연구에서도 long-read 플랫폼이 중요한 역할을 하고 있는데, 시퀀싱을 위해 dna나 rna가닥을 증폭시키지 않은 특징 때문에 가능 응용법이긴하죠. 특히 nanopre 플랫폼을 사용하여 급성 골수성 백혈병 (AML) 환자의 RNA변이와 fusion gene 구조를 확인하기도 하였고, 대장암 세포주에서 5mC 위치와 양을 정량하여 각각 AML와 대장암 연구에 도움이 되고 있다고 합니다.

이렇듯 Long Read Seq 플랫폼은 이제 쓰지 않을 이유가 없는 플랫폼으로 우리 곁에 생각보다 가깝게 다가왔으나 생각에는 Long이든 Short든 정확하게 내 병의 이유를 빠르고 "싸게" 알아낼 수 있으면 모두 행복한 것 아니겠습니까?

그럴 수 있는 방법이 어딘가에 있겠죠, 없으면, 언제나 그러했듯이 우리는 또 해답을 찾아내겠죠. :)

출처: @ye._.vely618

이제는 전체 16S rRNA 서열을 봐야하지 하지 않을까? 하는 얘기

마이크로바이옴 분석을 할 때 매번 나오는 얘기로 16S rRNA에서 V3-V4  영역만으로 괜찮겠냐, full 16S rRNA봐야하는거 아니냐? whole sequencing해야하는거 아니냐 라는 내용의 논문이 있엇 한번 가져와봤씁니다.

2019년에 출판된 "Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis" 종/strain 수준의 16s RNA 서열 평가에 대한 내용 되겠습니다.

DOI: doi.org/10.1038/s41467-019-13036-1

16S rRNA는 박테리아 분석, microbiome 분석 시 주로 사용해오고 있고, 지금도 활발히 사용되고 있는 분석 방법 이지만, 지금까지는 V3-V4 영역만을 대상으로하는 방법이었고, 이제는 전체 16S rRNA를 확인하는 것에 대해서 얘기해봐야 하는 시점이 되었죠.

이전까지 16S의 V3-V4 영역으로 구분이 안되는 종들이 있었고, 지금까지 하던 분변 마이크로바이옴은 모르겠다만, 다른 환경의 마이크로바이옴을 할때는 V4-V5가 더 좋아보이는데 너님들의 생각은 어때? 라는 논문이 꾸준히 나오는거 봐선 이제 전장 16S rRNA 방법이 두각을 나타날때가 되긴했죠 :)

바드에 물어보니 다음과 같이 요약해 주었습니다.

• 16S rRNA 유전자 시퀀싱은 미생물군집 내의 다양한 종과 균주를 식별하고 그들의 풍부도를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.
• 또한 미생물군집의 구성 변화를 추적하는 데 사용할 수 있습니다.
• 그러나 16S rRNA 유전자 시퀀싱은 균주 수준에서 정확도가 떨어질 수 있으며, 유사한 종을 구분하기 어려울 수 있습니다.
• 16S rRNA 유전자 시퀀싱의 정확도는 향상되고 있으며, 미생물군집을 연구하는 연구자들에게 유용한 도구입니다.

다른 미생물군집 분석 방법으로는 샷건 메타지놈 분석과 whole-genome 시퀀싱이 있지만 이 방법들은 16S rRNA 분석 방법보다 돈도 많이 들고, 시간도 더 많이 소요되니 너님이 궁금해하는게 무엇인지에 따라 선택해야하지 않겠니?

정도로 잘 요약해 줬습니다.V3-V4 수준이 아닌 고품질의 full 16S rRNA 데이터를 확보할 수 있으니 이제 V3-V4, V4-V5와 같은 좁은 영역이 아닌 full 16S rRNA로 microbiome 분석을 진행하는것이 좋아보이고, 이제 충분히 품질이나 비용이 만족할 수준까지 왔으니 더 나은 결과를 위해서 나와 함께 해보지 않겠는가? 라는 내용 되겠습니다.

출처: @ye._.vely618

NGS을 기반으로 하는 항체 선택 전략에 대한 insight에 대해서

11월의 첫 포스팅 링크드인에서 랩실 후배님께서 공유해주신 따끈한 논문 하나를 구글 바드에 한번 물어보았습니다.

항체 선택을 NGS를 사용하면 효과적/효율적으로 할 수 있다 에 대한 내용을 정리한 논문으로 제목은 "Insights into next generation sequencing guided antibody selection strategies" 입니다. 

doi: 10.1038/s41598-023-45538-w

- 논문 요약

NGS를 기반으로하는 항체 선택 전략에 대한 통찰력 제공.
NGS는 항체의 유전적 다양성을 빠르고 효율적으로 분석 할 수 있는 방법으로, 이를 활용하여 항체의 특이성과 효능을 개선 할 수 있습니다.

-논문 주요 내용

* NGS를 기반으로 하는 항체 선택 전략은 기존의 항체 선택 전략에 비해 보다 효과적이고 효율적입니다.
 ; NGS는 항체의 유전적 다양성을 빠르고 효율적으로 분석할 수 있기 때문에, 기존의 항체 선택 전략에 비해 보다 효과적이고 효율적입니다. 예를 들어, NGS를 사용하면 수백만 개의 항체를 한 번에 분석할 수 있기 때문에, 원하는 특성을 가진 항체를 보다 빠르게 찾을 수 있습니다.

* NGS를 기반으로 하는 항체 선택 전략은 항체의 특이성과 효능을 개선하는 데 도움이 됩니다.
 ; NGS를 사용하면 항체의 특이성과 효능을 개선하는 데 도움이 되는 항체를 선택할 수 있습니다. 예를 들어, NGS를 사용하면 항체가 특정 표적에만 결합하는 항체를 선택할 수 있습니다. 또한, NGS를 사용하면 항체의 결합력과 내성을 개선하는 항체를 선택할 수 있습니다.

* NGS를 기반으로 하는 항체 선택 전략은 다양한 질병에 대한 치료제 개발에 적용될 수 있습니다.
 ; 다양한 질병에 적용 가능: NGS를 사용한 항체 선택 전략은 다양한 질병에 대한 치료제 개발에 적용될 수 있습니다. 예를 들어, NGS를 사용하면 암, 감염병, 자가면역질환 등에 대한 치료제로 사용할 수 있는 항체를 개발할 수 있습니다.

논문의 저자들은 NGS를 기반으로 하는 항체 선택 전략이 항체 치료제 개발에 새로운 가능성을 제시한다고 결론짓습니다.

예로, NGS를 기반으로 하는 항체 선택 전략을 사용하여 특정 질병에 대한 치료 효과가 뛰어난 항체를 개발할 수 있습니다. 또한, NGS를 기반으로 하는 항체 선택 전략을 사용하여 항체의 독성을 줄이고 부작용을 개선할 수 있습니다.

NGS를 기반으로 하는 항체 선택 전략은 항체 치료제 개발의 새로운 장을 열 것으로 기대.

-시사점 

* NGS는 항체 치료제 개발에 필수적인 도구가 될 것입니다.

* NGS를 기반으로 하는 항체 선택 전략은 항체 치료제의 효과와 안전성을 개선하는 데 도움이 될 것입니다.

* NGS를 기반으로 하는 항체 선택 전략은 다양한 질병에 대한 새로운 치료제 개발을 가속화할 것입니다.

오... 그냥 bard에 물어보고 논문에 대해 추가 질문을 계속 물어보면 될듯하네요.

출처: @ye._.vely618

Clinical Trial 자료는 어떻게 확인 할 수 있을까?

미국 임상시험 자료는 잘 정리되어 공개되어 있기로 유명하죠

clinical trial 사이트에서 확인 가능한데 

매번 일일이 clinicaltrials.gov에 들어가서 찾기 귀찮은데..

근데 API는 사용할 수준은 안되고..

무슨 방법이 없을까하고 머리를 계속 굴리다보면 찾아지는게 인지상정 아니겠습니까,

물론 최근 새로 리뉴얼 된 clinicaltrial.gov에서는 제공되지는 않습니다.

예전 clinicaltrials사이트인 classic.clinicaltrials.gov에서 확인 가능합니다.

친절하게 다음 URL을 당신의 브라우저에 입력하면 파일을 다운로드 받을 수 있다 라고 얘기하고 있습니다.

https://classic.clinicaltrials.gov/AllPublicXML.zip

대신 이 파일이 최신 임상 시험 자료까지 포함하고 있다고 자신은 못할 것 같습니다. :)

내부에 미국 임상시험 DB를 구축하고 싶을 때 사용할 수 있음직한 파일이 될 것 같습니다.

다음에 또 유용한 정보를 가지고 돌아와보도록 하겠습니다. :)

출처: @ye._.vely618

롱리드 시퀀싱을 쓰지 않을 이유가 있는가?

이번 논문은 제가 참여한 논문입니다.. 흠흠..

이름하여 Two long read-based genome assembly and annotation of polyploidy woody plants, Hibiscus syriacus L. using PacBio and Nanopore platforms

DOI: 10.1038/s41597-023-02631-z

Hibiscus syriacus, 쉽게말해 무궁화 genome을 assembly하는데 어떤 데이터를 어떤 assembly 도구로하면 그래도 가성비가 좋은지에 대해서 확인한 논문 되겠습니다.

무궁화는 full genome은 이미 몇해전에 나와있는 상태고요, 아마 무궁화가 2배체가 아니라 4,6배체로 기억됩니다. 그래서 숏리드가지고 assembly가 만만치 않았는데 그 데이터를 바탕으로 이전에는 short리드로 어렵싸리 했었는데 이번에는 롱리드 시퀀싱으로 하면 어떻게 되는지 확인 해보자 입니다.

이전 무궁화 genome project 논문에서 핸들링하는 데이터 양을 정확히는 모르겠으나 어마무시했던것으로 알고 있습니다. 거기다가 숏리드라서 양쪽 로우 퀄리티 좀 정리해주고, scaffold용 mate-paired 데이터 정리작업하는데도 아마 꽤나 시간이 걸릴겁니다.

나노포어 데이터(ONT)와 PacBio data가 있었는데, 솔까말 ONT 데이터로만 해도... 사실 갠춘합니다.

그런데 여기서 중요한것은 ONT가 중요하기도 하지만 ONT의 장점을 십분 발휘할 수 있게 해주는 DNA 뽑는게 ART되겠습니다. ONT가 길게 읽을 수 있는거지 template가 짧으면 ONT도 길게 읽고 싶어도 못읽습니다.

결국 실험자의 손이 중요합니다. 손 똥손이면 ONT도 해결 못해줍니다.

그 똥손도 가능하게 해주는게 commercial prep kit이긴한데 현재 기준으로 그런 kit이 있는지는 저는 모르겠습니다. 

여튼 그래서 ONT 데이터를 앞뒤없이 다 때려박고 assembly하지 않았습니다.

cell 하나, cell 2개, 결과가 어떻게 달라지는지 확인해고, assembly tool마다 결과는 어떻게 나오는지 확인하면서 테스트 하였고, 이거쓰세요는 하지 못했지만 그럭적럭 요정도 생산해서 이 tool쓰면 평타 칩니다 라고 가이드는 해드릴 수 있는 논문되겠습니다.

다음에는 테스트하는 code를 간지나게 git에 올려놓고 논문에 url하나 올려둘 수 있도록 해봐야겠습니다. :)

그럼 또 쓸만한 논문을 찾아 돌아오도록 하겠습니다.

출처: @ye._.vely618

FFPE 처리된 암조직의 NGS 결과를신뢰할 수 있을까?

몇년전에도 NGS 분석 결과를 그냥 불신하는 분들은 당연히 계셨고 지금도 의심의 눈초리로 바라보는 분들이 없지는 않을겁니다. 물론 저도 NGS를 믿으십시요! 라고는 하지 않습니다. NGS가 모든 문제를 해결 해 주지는 않으니깐요. 그래도 진단에서 NGS는 꽤 나 중요한 위치를 차지하고 있고 효용성을 증명하고 있는데 일방적인 불신은 좋지 않겠죠.

2015년, 아직 NGS으로 진단하기에는 아직 무리이지 라는 의견이 지배적이었고, 그런 편견을 벗어나기 위해 부단히도 애를 쓰고 있었던 때인지는 잘 모르겠으나 그래도 아직 시기상조라는 분위기가 지배적이었던 시절 끊임없이 가능성을 보여주고자 노력했던 연구팀의 논문이 있어 한번 들고 와봤습니다.

그냥 일반 조직에서 시퀀싱한 결과도 믿을 수 없다고 하던 시절, FFPE처리된 샘플에서 BRCA1/2의 somatic 변이 검출을 신뢰 할 수 있다는 것을 보여주는 논문 되겠습니다.

"A reliable method for the detection of BRCA1 and BRCA2 mutations in fixed tumour tissue utilising multiplex PCR-based targeted next generation sequencing" 이라는 제목의 논문입니다.

DOI: 10.1186/s12907-015-0004-6

FFPE, 병리검사를 위해 띠어낸 조직을 장기 보관하기 위해서 처리하는 방법인데, 여기에 사용되는 praffin과 formaldehyde가 DNA 한테는 쥐약이죠..

그래서 FFPE 전용 DNA추출 키트도 나오고 있는데 이미 fragment되어 있고, damage받은 DNA 뽑아서 NGS 돌려봤자 그거 믿을 수 있겠냐? 라는게 FFPE 샘플을 가지고 NGS 수행후 분석 결과를 잘 못믿겠다고 하니 그래서 그거 우리가 확인 했어. 되겠습니다.

그래서 일단 제일 접근하기 쉬운 BRCA1/2를 타겟으로 하였고, 어차피 FFPE 샘플이니 서열들이 조각들 나 있을 테니 증폭시켜서 우선 DNA양을 늘리고 NGS해서 분석 해보자가 가장 좋은 선택지 아니었나 싶습니다.

그래서 다양한 변이 샘플 확보하고 NGS 키트 중에 여러 키트 (GeneRead V1, V2의 BRCA1/2와 Ion AmpliSeq BRCA1/2)로 상호 비교 실험도 했고, Sanger 실험으로 확인도 하였다고 합니다.

그래서 결과적으로 FFPE 샘플에서 추출한 DNA로 NGS 분석으로 돌연벼이를 확인 할 수 있었고, 일부 rare한 frequency를 가지고 있는 변이의 경우 Sanger로는 찾기 힘들었으나 NGS로는 찾을 수 있었다.

그러나 그래도 아직 germline을 분석(이 연구에서는 somatic BRCA1/2 변이를 탐지 했습니다.)을 대체하는 용도로는 안되고, 환자에게 득이 될 수 있는 PARP 억제요법을 사용할지 여부를 확인하는 용도로는 사용할 수 있을 것 같다라고 마무리하고 있습니다.

이처럼 그전까지는 카더라로마 떠돌었떤 근거없는 소문을 여러 다양한 케이스와 방법을 통해 벤치마킹을 하여 충분히 사용할 수 있는데? 라는 근거를 제시함으로써, 좋은 기술을 적재적소에서 사용 할 수 있게 해주는 것도 굉장히 중요한 일 인듯 합니다.

그럼 15년도에 FFPE로 somatic 변이를 NGS로 수행해서 변이를 찾을 수 있지만 제한적이라고 했는데, 지금은 기술이 더 발달 했는데, 그 제한적인 사용처가 극복이 되었는지? 아니면 그대로 별 차이가 없는지를 조만간 확인해보는 시간을 가지면 좋겠네요.

그럴 수 있기를 제발~  :)

출처: @ye._.vely618

Interpretation도 이제는 AI가 해야지

간만에 지난달에 출판된 따끈따끈한 논문 하나 읆어보는 시간 가져보도록 하겠습니다.

AlphaGo와 AlphaFold로 유명한 DeepMine에서 나온 논문으로 제목은 "Accurate proteome-wide missense variant effect prediction with AlphaMissense" 입니다.

DOI: 10.1126/science.adg7492

한 줄로 요약하자면 단백질 기능에 영향을 줄 수 있는 Missense Mutation가 발생하였을 경우 이 돌연변이가 질병을 유발할 수 있는 pathogenic 변이인지 알려주는 모델이라고 보시면 되겠습니다.

단, Missense Mutation 즉 아미노산이 바뀌는 유전적 변이에 대해서 pathogenic 정도를 알려 줄 수 있습니다. 아직 절반의 성공이긴 하죠. 

그래도 지금까지 인류는 missense mutation에 대해서 inpterpretation작업을 진행하였을 때 극소수, 논문에서는 0.1% 정도만 확인 하였다 라고 하고 있을 정도 극히 일부만 알 수 있었으나 이 AlphaMissense는 가능한 missense mutation 중 89%에 대해서 benign이나 pathogenic 을 구분할 수 있다고 합니다.

사실 AlphaMissense 모델이 나올 수 있었던데에는 AF, aka AlphaFold가 있었기에 가능했다고합니다. AlphaFold가 지구상에 있는 가능한 모든 단백질 구조를 예측하였고, 이 단백질 구조들을 바탕으로 정상적인 단백질 구조와 이상한 단백질 구조(질병과 관련있거나, 질병을 일으킬 수 있는)를 구분 할 수 있는 기초 자료가 되었다는 것이겠죠.

그리고 AlphaMissense에서 활용하는 정보들이 단순히 모델을 통해서 뚝딱뚝딱 만들어지긴 하였지만 수십년동연 연구하면서 쌓은 단백질 구조 정보와 진화적인 정보와도 일치하기도 하였다고 합니다. 1992년도에 발표되었던 BLOSUM인데, AlphaMissense가 학습한 아미노산 치환으로 병원성을 예측 하였을 때와 BLOSUM62 행렬을 바탕으로 병원성을 예측 할 때와 상관관계가 있었다고 합니다. BLOSUM은... 크... 

여튼 오늘 간만에 옛날 논문이 아닌 나름 따끈따끈한 논문을 읽어봤는데, 100% 이해하지는 못하나 그래도 이제는 머신러닝이나 AI를 사용하지 않고는 일을 하기 어려운 시대가 되어 가는 듯합니다. 모델을 구현하고 생성할지는 못할지언정 평가하고 활용은 해야지 다가올 미래에 밥벌이는 할 수 있지 않을까 합니다.

그리고 안타깝게도 AlphaMissense Code는 아파치 라이센스로 사용에 문제가 없으나 AlphaMissense 예측 코드는 BY-NC-SA 4.0으로 상용적으로 활용이 어렵겠네요..

저런저런... Orz

출처 : @ye._.vely618

WES를 하는데 Capture가 좋을까 Amplicon이 좋을까?

Evaluation of Hybridization Capture Versus Amplicon-Based Methods for Whole-Exome Sequencing 라는 제목의 WES(Whole Exome Sequencing)를 하는데 Hybridization Capture가 좋은지 Amplicon이 좋은지 비교해본 논문이 있어 한번 들여다 보았습니다.

doi: 10.1002/humu.22825

사실 2023년 현재 WES를 하는데 Amplicon을 한다고 저는 말리지는 않겠지만, WES를 Amplicon으로? 라고 왜 Amplicon으로 하는지 궁금한 눈빛으로 바라보긴 할 것 같습니다.

이 논문은 당연히 2015년에 출판된 논문으로, 그 때 당시에는 한번 짚고 넘어가야 할 수 밖에 없는 내용이었고, 당시에 이런 벤치마킹 연구를 해주었기 때문에 현재 우리가 큰 의심없이 WES할 때는 Capture지를 외칠 수 있지 않나 합니다.

물론 가까운 시일내에 고성능의 간섭 없는 Amplicon 방법이 개발되면, 2025년에는 WES는 Amplicon이지! 할지 누가 또 알겠습니까 :)

여튼 논문에서는 2015년 당시 대표적으로 사용되던 Capture 방법 2가지(SureSelect, SeqCap)와 Amplicon 방법 2가지(HaloPlex, AmpliSeq) 를 상호 비교해보았습니다.

아직도 SeqCpa과 HaloPlex로 생성된 데이터를 한번도 만져보지를 못해서 얼마나 데이터가 깨끗한지, 쓸만한지는 모르겠습니다. 다만 SureSelect와 AmpliSeq은 지금도 사용하고 있으니 그 기술을 꼭 알아야 할까 하는 의문이 있습니다.

그리고 시료로는 변이들이 잘 정의된 것들을 사용하지 않았나 싶네요

BT-20, MCF-7, HCC-2218, HCC-2218BL 4개 셀라인을 사용한듯 싶습니다.

그리고 결과 비교 중에 SNP말고도 copy number를 확인하는데 copy number 확인을 위해  Affy사의 SNP Array 6.0도 함께 진행하여 HCC-2218, HCC-2218BL의 copy number를 확인 하였습니다. 굳이 NGS를 하는데 microarray도 해야돼? 라는 생각이 드셨다면, 이 논문이 발표된 시점이 2015년이란것을 잊지 않으셨으면 합니다. :)

그래서 이런저런 당시 일반적으로 사용되었던 정렬 툴과 각 Library에 적합한 정렬 툴을 사용하여 정렬하고, 다음에는 각각 SNV와 InDel, Copy Number 관련된 분석 툴을 사용하여 비교해보았고,

지금의 우리가 알고있는것과 동일하게 Capture방식이 Amplicon 방식보다 시쿼싱 복잡성(? 이건 어떤의미인지 잘 모르겠습니다.)과 균일성 (Uniformity)관련해서 더 좋은것을 확인했고, 위양성 변이가 탐지될 가능성도 적음을 확인했다고 합니다.

그러니 WES 할 때는 안심하고 Capture 방식 사용하세요 되겠습니다.

 출처: @ye._.vely618

cnvkit 설치 방법

간만에 프로그램 설치 기록 하나 남겨 봅니다.

설치할 tool은 Copy Number Variant 탐지에 대명사 중 하나인 CNVKit입니다.

참조할 사이트는 당연히 공식 cnvkit github고요 

첫번째 방법은 conda를 이용한 방법!

$ conda config --add channels defaults 
(conda를 설치해서 사용하시는 분들은 굳이 defaults는 안하셔도 됩니다.)

$ conda config --add channels conda-forge
$ conda config --add channels bioconda
$ conda install psutil
$ conda create -n cnvkit cnvkit
라고 명령어를 입력하면 엄청 많은 패키지들을 설치하겠다고 나옵니다.

$ source activate cnvkit

(cnvkit)$ python cnvkit.py -h

numpy가 없다고 나와서 다음과 같이 가상 환경 안에서 numpy 설치

(cnvkit)$ conda install numpy

그러나 conda를 이용한 방법은 제대로 작동을 안해서...

$ source deactivate

이유는 꼭 알아야 할까요? 다른 방법으로 설치하면되지요!

그래서 걍 github에서 소스 파일 다운 받아서 pip를 사용하여 설치!!

$ git clone https://github.com/etal/cnvkit

$ cd cnvkit/

$ pip install -e .

$ ~/Python-2.7.12/bin/python cnvkit.py -h

기본 pip를 사용했기 때문에 python-2.7.12에 설치가 되었고, 만약 pip3를 사용하여 설치하였다면... python3을 이용하면 되었을 것으로 예상됩니다.

그래서 오늘은 conda와 pip를 이용한 설치 방법에 대해서 알아보았습니다.

다음에 또 유익한 정보를 가지고 찾아오도록 하겠습니다.

출처: @candyz_hyojung

탐지한 varaint가 대체 왜 이러지?

이것저것 변이 call을 하다보면 가끔씩 여러개의 변이가 한번에 call되는 경우가 있습니다.

여러개의 변이가 한번에 call되는 경우는 대게 multi allelic 이거나 multi-nucleotide variant 정도일겁니다.

※ Multi Allelic

1번 염기서열 위치에 Reference는 TA였는데 변이 call결과에 T,TAA,TAAA 가 확인되었을 때 를 얘기하는 경우

※ Multi Nucleotide Variant

159030번 염기서열 위치에 Reference가 TAACCTTTC였는데, TGACCTTTT로 call되었다고 하는 경우, 일반적으로 이런 경우 159031번과 159038번만 reference와 다른데 왜 뭉뚱그려서 여기가 다 변이입니다 하는 경우 입니다.

TAACCTTTC

TGACCTTTT

그러나 다행히 우리에게는 VT라는 천하무적 tool이 있습니다.

이런 multi allelic나 multi nucleotide variant 가 있는 경우 이것을 뜯어서 분리하는 sub command를 가지고 있다고 하네요 :)

난 multi Allelic를 분리하고 싶어요! 라면 

vt decompose input.vcf -o decomposed.vcf 

이렇게

아니에요 나는 multi nucleotide variant를 분리하고 싶어요! 라면

$vt decompose_blocksub -p input.vcf -o decomposed.vcf 

이렇게 명령어를 실행시켜 주면 된다고 합니다.

multi allelic가 나오고 multi nucleotide variant가 당신을 괴롭히더라도 당신 곁에는 vt가 있다는 것을 잊지 마세요.

다시 또 유익한 정보를 가지고 돌아오도록 하겠습니다. :)

출처: @ye._.vely618

무균체액에는 얼마나 다양한 박테리아가 있을까? 그 10년의 기록

10년에 걸쳐 뇌척수액, 심낭액, 복막 및 흉막액 같은 체액(NSBF)에 어떤 박테리아들이 서식하는지 확인한 논문이 있어 한번 가져와봤습니다. 

제목은 Comparison of 16S Ribosomal RNA Targeted Sequencing and Culture for Bacterial Identification in Normally Sterile Body Fluid Samples: Report of a 10-Year Clinical Laboratory Review 이고, doi는 10.3343/alm.2020.40.1.63 입니다.

테스트한 샘플은 312개의 NSBF이고, 16S rRNA 분석과 배양 실험을 동시에 진행하여 비교해보았다고 합니다.

metagenome을 사용하는 이유가 시간도 오래 걸리고 번거로운 배양실험을 대체하기 위한 목적이 크다보니 비교실험을 통해 사용에 당위성을 확보하기도 합니다.

여튼 10년동안 모든 음성 샘플 277개와 양성 샘플 35개 중 277개의 음성 샘플을 정확히 구분해 냈으나 35개 샘플중 시퀀싱과 배양 방법을 통해서 확인된 양성 샘플은 10개 였습니다.

전체 312개 중 92%의 정확도? 라고 할 수 있으나, 이 10개 샘플은 16S rRNA와 배양 방법으로 모두 양성이라고 확인한 결과이고, 16S rRNA 방법으로, 배양 방법으로 확인한 결과는 35개 모두 다 잘 진단 하였습니다. 

그래서 논문에서도 기존의 배양방법으로만 하는 것보다 16S rRNA 시퀀싱 방법을 배양 방법과 함께 사용하면 체액 샘플에서 박테리아를 더 정확하게 식별할 수 있고, 항상제를 이미 처방받은 환자나 혐기성 감염이 의심되는 경우 배양 방법만으로는 한계가 존재하기 때문에 함께 사용하는것이 좋은것 같다는 의견이었습니다.

개인적으로는 16S rRNA 단독으로 사용하였을 때 앞도적인 차이로 더 잘 진단 할 줄 알았는데 꼭 제 마음같지는 않은듯 합니다. :)

음... 근데 안타깝게도 시퀀싱 데이터가 공개되어 있지 않은듯 한데.. 좀 더 자세히 뜯어보도록 하겠습니다. SRA 번호를 찾게되면 한번 분석 해보는 것으로 :)

그럼 다음에 또 흥미로운 논문으로 찾아뵙도록 하겠습니다.

출처: @ye._.vely618

누가누가 미생물 프로파일링을 잘할까?

NGS가 태동된지 20여년.... (너무 과했나?) 대중적으로 관심을 받아 쓰는지는 10여년이 훌쩍 지나가고 있는 시점에 예전에는 454나 Solexa 정도 만져보던 시절에서 지금은 다양한 시퀀서들이 나와서 연구자들의 다양한 궁금증을 일선에서 해결해 주고있습죠 :)

여튼 그래서 21년 기준에 보편적으로 또는 미래에 대세가될 시퀀서들을 대상으로
누구나 관심있어하는 장내 미생물 프로파일링을 어느어느 시퀀싱 플랫폼이 잘하나 비교해보는 논문이 있어서 가져와봤습니다.

제목은 Comparison of 16S rRNA Gene Based Microbial Profiling Using Five Next-Generation Sequencers and Various Primers 이고,

doi: 10.3389/fmicb.2021.715500 입니다.

(물론 저자중에 제가 아는 분이 있어서 그런것은 아니고요, 구글링 하다가 찾아진겁니다.)

그래서 비교해볼 시퀀서는

MiSeq, IonTorrent, MGIseq-2000, Sequel II 그리고 MinION 까지.. ..
짧은 read와 긴 read들을 생산하는 대표 시퀀서들을 5개를 가지고 테스트를 해봤습니다.

시퀀싱을 잘 했는지 못했는지 확인하려면 시료의 정답을 미리 알고 있어야 겠죠?

그래서 한국 식약처에 등재된 19종의 미생물 종중에 8종을 선별하여서 다양한 비율의 Mock community를 만들어서 테스트 했다고 합니다. 

그런데 Mock community내에 미생물들의 비율은 어떻게 확인했냐!!
digital PCR을 사용해서 Mock community내 미생물들을 정량해서 확인했다고 합니다. 물론 Sequins (스팽글?, aka Sequencing spike-ins)이라는 방법을 활용할 수 있다고 하는데 다양한 박테리아에 대해서 모두 Sequins를 만들기 어렵기 때문에.. 이방법을 사용했다고 합니다. 사실어떤 방법이 golden standard인지는 모르겠으나 연구 디자인에 적합하면 되지 않을까 합니다.

여튼 8개 Mock community를 제작하였고, 각각에 시료를 바탕으로 5개의 시퀀서로 시퀀싱을 진행하였습니다. 그리고 분석은 MOTHUR을 사용해서 진행하였다고 합니다.

그럼 결론은 몬데?
뭣이 중헌디?

음... 개인적으로는 16S rRNA 서열을 한번에 확인 할 수 있는 롱리드 플랫폼이 숏리드 플랫폼보다 편향이 적다라는 결과를 기대했으나.. 도리어 숏리드 플랫폼에 비해서 롱리드가 더 편향적(과대 또는 과소 표현)이었다는... 물론 이게 긴 길이의 리드를 시퀀싱하기 위해서 전처리로 PCR단계에서 비롯된거 같다는 의견이었습니다만, Sequel II같은 경우 숏리드 플랫폼과 유사한 양의 결과물을 확인하기 위해서는 더 많은 비용이 소요될텐데... 그럼 롱리드 플랫폼을 사용할 이유가 딱히 없다는게 문제가 될듯합니다.

Figure 3,4,5를 잘 뜯어보면 

Bifidobacterium breve의 경우 숏리드 플랫폼에서 상대적으로 과소 표현되고,
Limosilactobacillus fermentum의 경우 롱리드 플랫폼에서 과소표현되고, 반대로 Lactococcus lactis subsp. lactis의 경우 롱리드에서 과대표현 되고,
Lactobacillus acidophilus의 경우는 플랫폼 상관없이 과소표현 되기도하고..

함께 있는 종에 따라 영향을 받기도, 받지 않기도 하기 때문에 해석을 할 때 고려해야할게 한두가지가 아니라서 좀 어렵죠. ㅎㅎ 

그리고 숏리드의 경우 가장 큰 문제점이 한정된 영역(V3-V4)의 서열만 가지고 확인하다보니 서로 다른 균주로 분류되는 문제가 있었고 이는 보통 probiotic bacteria인 Lactobacillus casei group(LCG)에서 확인되어서 LCG, probiotic bacteria 분석에는 V3-V4는 좀 피해야할듯 합니다.

결론은 연구에 맞게 적절하게 잘 사용하고, 직접 실험하지 않는 저같은 게으름뱅이들에게는 이리저리 분석할때 표준 데이터로 사용할만한 좋은 데이터가 확보되었다는 것입니다. :)

출처: @ye._.vely618

NCBI에서 제공하는 ribosomal RNA Database

때는 바야흐로 2020년 초

NCBI에 Blog에 새로운 ribosomal RNA 데이터베이스가 출시되었다는 글이 하나 떴었네요...

사실 그 전부터 BLAST용 ribosomal RNA 서열은 제공하고 있었습니다.

다만 그 전까지는 NCBI에 수집된 nucleotide 서열을 모아놓은 수준이었던것 같은데,

2020년에 공개된 데이터는 단순히 모아놓는 부정확한 정보 수준이 아닌 각 서열을 정확하게 식별하고 분류할 수 있도록 엄선하였다고 하네요 

rRNA뿐만 아니라 ITS 서열까지.. 2020년즈음에는 microbiome에 이어 mycobiota도 관심이 증가하고 있었던 시기였던터라 이전에 ITS 서열을 제공하지 않았던것 같은데, 역시 NCBI 훃님들은 페달 밟으면 아주 시원하게 뽑아주는듯 합니다.

여튼 요즘에는 16S, 18S, ITS 서열들을 잘 정리해서 식별할 수 있도록 (aka taxonomy 정보가 잘 정리되어 있다는 것이겠죠) 제공하고 있습니다.

>여기< 에 우리가 알고 있는 nt db와 nr db 말고도 다양한 local용 blast database들이 제공되고 있으니 잘 다운로드 받아 잘 사용하면 좋을 것 같습니다. 

또 유익한 정보를 가지고 블로그에 글을 적어보도록 하겠습니다. 

출처: @ye._.vely618

SAM-TB, 주인공은 나야나

결핵은 참 끊임없이 인류를 괴롭혀오는 감염병균 하나입니다.
더구나 이 녀석이 악랄한 이유는 누구에게나 동일하게 감염되는것이 아닌 개발도상국이나 저소득구간에 있는 생활환경이 그리 좋지 않은 나라나 가정에 더 잘 발병한다는 것입니다.

선진국, 다른 말로 고소득국가나 생활환경이 더 나은 곳에서 사는 사람들에게는 감염되지는 않지만 그래도 전세계가 관심있게 모니터링하고 있는 감염균중 하나일겁니다.

그래서인지 분석 Tool들이 생각보다 많이 나와있습니다.

물론 대부분 파편화되어 있었으나 최근들어 포괄적인 분석 tool들이 등장하고 있습니다.

오늘 소개하는 tool도, 이거 하나만 있어봐!!

다 할 수 있어 되겠습니다.

SAM-TB: a whole genome sequencing data analysis website for detection of Mycobacterium tuberculosis drug resistance and transmission

doi: 10.1093/bib/bbac030

이 분석 tool은 결핵균의 WGS한 데이터를 분석하는 tool이고, 약물 내성과 spoligotyping 및 NTM이라면 어떤 NTM 종인지도 구분할 수 있다. 즉 SAM-TB 하나면 결핵에 관련된 모든것을 다 확인 할 수 있습니다. 되겠습니다.

기존에 나왔었던 다양한 MTB 분석 tool들(KvarQ, PhyResSE, TGS-TB, CASTB, Mykrobe, TBProfiler, MTBseq 및 ReSeqTB-UVP)을 언급하면서 우리는 지금까지 나왔던 모든 분석 프로그램의 기능을 구현하고 있다라고 자랑하고 있고, 그런 tool을 웹에서 분석 해보실 수 있습니다. 라고 자랑하고 있습니다.

어디서? 바로 >여기<에서!!

근데 안타깝게도 오늘 (2023년 8월 29일 기준) 접속이 안되더라구요.

내일은 되길 바라겠습니다.

일단 다시 한번 중요 포인트를 짚어보자면,

MTB WGS 데이터를 사용하여
 약물 내성 변이 확인, 
 spoligotyping 확인,
 MTBC 및 NTM 확인
을 웹상에 업로드하여 분석 할 수 있다 되겠습니다만 가장 중요한 분석 사이트가 접속이 안되네요

여튼 기존에 1%씩 부족했던 기능을 가지고 있던 tool을 한 자리에 모아놨다가 가장 큰 의의일것 같습니다. 

생각보다 특이할만한 tool은 사용하지 않았고, 일반적인 NGS 분석을 해보셨다면 다뤄봤을 그런 tool들로 잘 구현했습니다.

BWA-MEM, samtools, VarScan, Kraken2와 각종 in-house script들...

사실 중요한게 약물 내성 변이의 db와 lineage, MTBC 및 NTM을 확인 할 수 있는 정보에 대한 내용이 더 잘 설명되어 있으면 좋았을텐데 그 내용은 살짝 빠져있는게 아쉬웠네요 

작년 초에 출판되었는데 벌써 웹사이트가 막히다니.. 

살짝 아쉬움을 남기고 오늘 글은 마무리하도록 하겠습니다. 

@ye._.vely618

SpeedSeq은 어디에 쓰는거지?

오늘은 연식은 좀 되었으나 빠른 분석 tool하나 가져와봤습니다.


SpeedSeq: ultra-fast personal genome analysis and interpretation

doi : 10.1038/nmeth.3505

이름하여 SpeedSeq!! 그래서 제목에 ultra-fast, 초고속이 들어갑니다.
근데... 분석시간이 얼마나 걸렸었는지는.. 기억이 잘..

논문에서는 저렴한 서버에서 50x WGS데이터를 13시간만에 align을 했다고하는데...
(저렴한서버의 정의는 CPU 16core에 128GB RAM이 장착된 서버라고 하네요)

여튼 논문에서는 50x WGS 데이터를 저렴한 서버를 사용해서 분석을 진행할 때 정렬 작업을 시간단위에서 끝냈다.. 라는 소식을 솔직히 DRAGEN 제외하고서는 들어본적이 없어서 조금 갸우뚱 하긴 합니다.

여하튼 논문에서 13시간만에 정렬을 끝냈다고 했다니!! 그렇다고 믿는게 인지상정 아니겠습니까?

근데 정렬 속도가 빠른건 큰 장점이지만 단순히 속도만 빠르면... 그건 아무짝에도 쓸모없는거죠

그래서 SpeedSeq와 기라성같은 변이 탐지 툴들과도 비교 해봤습니다.

somatic/germline 분석 툴들을 가리지 않고 모두 비교해봤습니다. GATK의 Haplotype Caller, Mutect, VarScan2와 같은... 기존에 너님들이 많이 쓰던 툴들이랑 비교해서 결과 다르지 않아. 라고 얘기하고 있습니다.

그런데 사실 저는 SpeedSeq을 사용한 이유가 속도가 빠르면서 bwa와 같은 기존 정렬 프로그램 대비 결과가 정확해서 사용한것이 아닌 그냥 LUMPY tool을 사용하기 위해서 였다는게 함정

사실 이 정렬 tool이 nature에 출판되었는지도 몰랐다는..

LUMPY사용하려고 메뉴얼보니 SpeedSeq 결과 사용하세요 라고 적혀 있어서 단지 사용 했었을뿐... 그 후에 나도 몰라 하고 있었는데...

그냥 한번 들쳐봤는데 다시 검토해볼만한 tool일거 같긴한데..

"Reference Sample 백만번 돌려서 결과 동일해요" 하는것보다 임상 샘플 10개만 분석해봐도 그 진가를 알아볼수 있으니...

만약에 제가 사용하게 된다면 다음에 다시 글하나 올려보도록 하죠 :)

출처: @ye._.vely618

누가 누가 Annotation을 잘 하나

작년에 나온 논문으로 NGS를 활용한 임상 유전체 판독 할 때 어떤 annotation tool을 쓰면 좋을지에 대한 내용입니다.

A performance evaluation study: Variant annotation tools - the enigma of clinical next generation sequencing (NGS) based genetic testing

doi: 10.1016/j.jpi.2022.100130

현재 다양한 annotation tool이 사용되고 있긴 하나 그 중에서 Alamut, ANNOVAR, VEP 3개 tool을 벤치마킹 해봤다고 합니다.

VEP는 Ensembl Variant Effect Predictor이고,
Alamut는 SOPHiA GENETICS에서 제공하고 있는 tool,
ANNOVAR은 qiagen에서 제공하고 있는 tool로 3개 tool 모두 annotation해봤다고 해봤으면 한번쯤 구경은 해봤을 tool 일겁니다.

결과를 얘기하자면 이 3개 tool을 이전에 확인되었던 298개 변이를 대상으로 벤치마킹하였고 이 중에서 VEP가 가장 성능이 좋았고, ANNOVAR이 가장 낮을 일치율을 보여주었다고 합니다. (298개 중 20개가 불일치하여 93.3%의 일치율)

그래서 Lurie Molecular Diagnostics Laboratory(저자들의 소속 기관)은 VEP를 사용하기로 하였다고 논문에 언급하긴 했는데 진짜 VEP를 사용하고 있는지 ANNOVAR나 Alamut를 몰래 사용하고 안하는지는 제가 알 방법이 없네요

여튼 NGS의 발달로 말미암아 WGS를 하면 400만개, WES를 하면 ~2만개 정도의 변이들을 탐지할 수 있게 되었죠. 그래서 이전에는 변이를 하나하나 탐지하는게 병목점이었다면 이제는 탐지된 변이를 정확하게 판독 할 수 있도록 annotation을 하는 것이 더 중요하고 병목점이 되었다는 것은 누구나 부인하지 못할 것입니다.

- 물론 최근에는 AI/머신러닝의 발달로 annotation 단계에서도 괄목할만한 신속 정확한 결과를 바라볼 수 있지 않을까 합니다. -

이런 이유로 Lurie Molecular Diagnostics Laboratory에서도 이전에는 Alamut를 사용하고 있었는데 라이센스 문제등 효율적인 문제가 부각되어 상용 tool들과 오픈 소스인 VEP간의 annotation 결과 일치도 테스트를 해보게 되었다고 합니다.

그렇다면 비교를 하기위해서는 정답이 있는 문제지가 있어야 되겠죠?
그래서 이전에 Lurie Molecular Diagnostics Laboratory에서 진행되고 큐레이션 되었던 191개 유전자에 있는 298개 변이를 테스트 세트로 했다고합니다.

3개의 annotation tools을 비교하기 위한 vcf를 준비해서 각각 분석을 진행하였다고 합니다.

그래서 확인한 결과 298개 중 278개 변이는 3개 tool에서 모두 동일하게 확인되었고, 그 중 VEP와 Alamut는 99% 일치 하였으나, ANNOVAR의 경우 20개가 불일치 하였다고 합니다. 298개 중 278개 변이가 3개 tools에서 동일하게 나온 이유가 ANNOVAR가 제대로 분석을 하지 못해서였네요.. 

VEP는 298개중 297개를, Alamut는 298개중 296개를 올바르게 annotation을 하였고, ANNOVAR은 위에서 언급한대로 278개만 올바르게 annotation을 하였다고 합니다.

조만간 누군가 고도화된 AI/머신러닝을 탑재한 annotation tool을 출시하면 새바람이 불지 않을까합니다.

그때까지 밥벌이는 해보는걸로 :)

출처: @ye._.vely618

16S rRNA에서 V3/4와 V4/5는 대체 얼마나 다르지?

정확히 얘기하자면 북극해의 해양 생태계의 미생물 군집을 연구할 때는 16S rRNA의 어느 variable region을 사용하는게 좋을까? 되겠습니다.

Comparison of Two 16S rRNA Primers (V3–V4 and V4–V5) for Studies of Arctic Microbial Communities

doi: 10.3389/fmicb.2021.637526

예전부터 microbiome, metagenome연구할 때 항상 언급되는 내용이긴 합니다.
엄밀히 얘기하면

1. 박테리아 genome full sequence가 제일 좋아요
2. 안되면 full lenght 16S rRNA가 좋아요
3. 안되면 그냥 본인이 이거다 싶은거 쓰세요. 다른사람이 무엇을 쓰든지

여튼 이 논문은 빠른 온난화로인해 북극해의 해양 생태계가 어떻게 변화하는지 확인해보고자 1년여동안 모니터링한/샘플링한 데이터를 분석해봤는데, 지금까지 우리가 대중적으로 사용하고 있었던 16S rRNA의 V34가 진짜 golden standard인가? 우리 한번 생각해봐야하지 않겠나? 아니면 적어도 북극해의 미생물 분석 할 때는 (우리가 해봤을때는) 16S rRNA의 V34보다는 V45가 더 적합한것 같아요를 얘기하고 있는 논문되겠습니다.

여기서 얘기하고 있는 16S rRNA의 V34는 어디고 V45는 어디냐?

16S rRNA는 >여기< 참고하시면 잘 나와있습니다. 그리고 그중 V34와 V45는 어디냐?

V34는 341(F)에서 785(R)까지, V45는 515(F-Y)에서 926(R)까지라고 하네요

사실 범용적으로 사용하는 primer 위치들이 연구팀들마다 100% 동일하지는 않습니다. 살짝씩 다를 수 있으니 이 부분도 잘 확인하시면 좋을 것 같습니다.

그 이유는 이 논문에서도 언급되었듯이 지금까지 지금까지 연구가 잘 되어오지 않았던 곳(여기서는 북극해)에서는 어떤 variable region이 종들을 더 잘 구분하는지, 어떤 범용 primer set이 더 잘 작동하는지 정확히 모르기 때문에 그렇습니다. 반대로 사람의 대변, 구강과 같이 이미 수년동안 연구를 통해 실험 방법이 정립된 경우에는 그냥 기존 방법대로 하시면 되겠습니다.

그래서 이 논문의 결론은 북극해와 같이 아직 생태계가 연구되지 않은 환경에 대해서 미생물 군집 연구를 위해서는 V45 primer set을 사용하는 것이 좋다고 하였습니다.

근데 진짜 그럴까요?

논문에서도 나오지만 결론에서 북극해의 미생물 군집 연구를 위해서는 V45가 좋은데, 그 이유가 다른 미생물 군집 검출에 영향을 끼치지 않기 때문이고, archaea도 검출 가능하기 때문인데, V45와 함께 V34를 혼용해서 사용하면 더 좋지 않을까하는 생각이네요

그리고 사족으로 일부 샘플에서 현미경으로 셀 카운팅을 했는데 그 결과가 NSG와 차이가 있었고, 그 이유가 현미경 정량의 한계라고 얘기를 하였지만 꼭 그럴까하는 생각도, NGS의 한계일 수 도 있다는 생각은 >여기<를 보시면 알게 된다는..

그럼 다시 또 재미있는 이야기거리를 가져와 보도록 하겠습니다.

출처: @ye._.vely618

NCBI기반의 분류데이터를 손쉽게 다루는 방법

NCBI의 taxonomy 데이터는 드려다 보신 분들은 아시겠지만 환장의 도가니라고 할 수 있죠

그래서 보다 못한 호주의 어느 용자께서 NCBI의 taxonomy 데이터를 처리할 수 있는 스크립트를 개발하셔서 github에 올려주셨습니다. 물론 논문도 투고하셨고요

이름하여 ncbi-taxonomist, NCBI 분류학자라니.. Orz

Collecting and managing taxonomic data with NCBI-taxonomist

doi: https://doi.org/10.1093%2Fbioinformatics%2Fbtaa1027

여튼 재미있는 기능 중 하나가 NCBI의 nucleotide이든 protein이든 accession을 입력하면 이 accession의 taxonomy 정보를 알려준다는 것입니다.

물론 NCBI 분류학자답게 NCBI의 taxonomy ID과 종 이름(약간의 오타가 있어도, 그 오타가 NCBI에 등록되어 있다면)로도 검색할 수 있습죠.

accession 정보를 이용하여 taxonomy 정보를 파악하는게 생각보다 번거로운 작업인데 ncbi-taxonomist에서 명령어 한번 때려주면 호로록 검색해서 결과를 알려줍니다.

여튼 오늘은 간단한 기능을 보여주는 tool을 소개하였는데
밤새 태풍에 무탈하시기 바랍니다. :)

출처: @ye._.vely618

microbiome 시퀀싱 데이터는 얼마나 잘라내야 결과가 좋을까? for DADA2

요즘 QIIME2를 뒤적이고 있는 차에 쓰임이 많아 보이는 논문이 하나 있어서 투적해봅니다. (물론 greengene2만큼일련지는...)

Trimming conditions for DADA2 analysis in QIIME2 platform

doi: https://doi.org/10.11620/IJOB.2021.46.3.146

사실 QIIME2를 사용할 때뿐만 아니라 metagenome 분석을 할 때 한번은 짚고 넘어가야 하는 내용을 다루고 있어서 거쳐야 하는 단계를 가볍게 넘어가게 할 수 있지 않을까 합니다.

바로 metagenome분석시 qiime2에서 DADA2를 이용한 최적의 read trimming 조건 찾기 입니다.

metagenome 연구를 할 때 일반적으로 일루미나 플랫폼의 V3/4 region을 target으로 시퀀싱을 진행하게 됩니다. 16S rRNA가 종 동정에 많이 사용되고 16S rRNA의 가변 영역인 V1~V9중 해상도가 괜찮은 부분인 V3/4라고 연구되어 있기 때문에 일반적으로 많이 사용하고 있죠

V3/4은 대략 440bp정도이므로 안타깝게도 일루미나의 한쪽 read만으로는 V3/4 영역을 커버할 수가 없습니다. 그래서 pair로 짝을 이뤄 중간에 overlap되게 하여 시퀀싱을 진행하고 overlap되는 서열을 활용하여 merged/stitch 하게 됩니다.

이때 Read1에서는 얼마나 잘라내고 Read2에서는 얼마나 잘라내야지 내 피 같은 연구비를 들여서 생산한 데이터를 최대로 활용하면서 좋은 데이터를 확보할 수 있을까? 가 중요하게 됩니다.

그래서 이 연구팀은 QIIME2의 DADA2를 사용하여 Read1과 Read2를 얼마나 trimming해야지 내 데이터에서 좋은 결과를 뽑아낼 수 있는지에 대한 다양한 실험을 통해 확인하였습니다.

QIIME2에는 DADA2말고 deblur도 있는데 delbur는 왜 안 했어? 라고 하신다면 안타깝게도 deblur는 single read에서 작동된다고 되어 있으니 deblur 결과가 궁금하신 분께서는 직접 해보시는 것도 좋은 선택지 같습니다. :)

여튼 Read1과 Read2의 여러 수치의 trimming 조건과 trimming후 read merge/stitch 이후 chimera 서열로 보이는 데이터의 양, 그리고 trimming에 따라 얻어진 데이터의 미생물의 풍부도(Alpha Diversity)까지, 세심하게 trimming에 따른 결과 영향까지 확인해서 논문에 실어주었네요

사실 빡빡 trimming해서 좋은 quality base들만 남겨 논들 read merge/stitch가 되지 않고, 죄다 chimera라고 나와버리면 무용지물이다 보지 trimming 이후에 trimming의 영향에 대해서도 함께 평가해서 적절한 trimming 지점을 제안해주고 있습니다. 

결과적으로 Read1은 1사분위의 read quality가 Q20가 되면 이제 그 위치부터는 헤어져야 하고, Read2는 Read1과 overlap되는 길이가 16bp이상만 되도록 조절(trimming)해주면 결과에 나쁜 영향을 미치지 않는 -개인적으로는 망하지는 않는 조건이지 않을까 합니다- trimming 조건이라고 얘기하고 있습니다.

그럼 다음에 또 재미있는 내용으로 찾아와 보도록 하겠습니다.

출처: @ye._.vely618

ncbi 횽아들은 어디까지 만들어 낼 것인가

이것저것 작업하면서

ncbi tool들을 다시 사용하고 있는데..

훗.. 역시 우리 ncbi 훃아들의 위대함을 다시 한번 느꼈다는...

NCBI BLAST에서 taxonomy로 제한 거는 기능을 당연히 stand-alone에서도 사용할 수 있는데 NCBI의 -taxid의 숨은 함정이 종 수준의 taxid만 제한 걸 수 있다는..

(근데 써보면 종 수준의 taxid만 제한이 걸리는지 갸우뚱 거리긴 함.. )

여튼 종 수준의 taxid만 제한할 수 있다는 것이 무엇이냐면..

종보다 상위 class의 taxid인 Enterobacterales의 taxid를 사용하면 정상적으로 작동을 안하게 된다는 말씀.

그러므로 NCBI BLAST 프로그램을 다운 받았을 때 함께 있는 get_species_taxids.sh를 활용하면 이 문제를 피해갈 수 있다고 합니다.

사실 최근까지 get_species_taxid.sh가 왜 있는지 관심은 없을 뿐더러
왜 쓰잘떼기 없는 shell script는 왜 넣어놨는지 했다는 ㅎㅎ 

여튼 언제나 NCBI 훃님들께 감사인사를... :)

참고 URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK569846/

출처: @ye._.vely618

왕의 귀환, greengene2

어이쿠... 기억속에 잊혀져 있던 database가 우리 곁으로 다시 돌아왔네요

옛날에 metagenome 한번 해봤으면 썼었던 바로 그 db, greengene이 버전업 해서

greengene2으로 아래 논문으로 돌아왔습니다.

Greengenes2 unifies microbial data in a single reference tree

역시 우리 Rob훃아가 찬밥 신세로 있었던 greengeen을 멱살 잡고 끌고 온듯합니다.

단순히 greengene의 빈약했던 taxonomy정보만 벌크업 한것이 아닌 16S rRNA와 shotgun metagenome 결과를 비교할 수 있도록 개선했다고 합니다.

여튼 metagenome 하면서 다들 느낀 점은 시퀀싱 방법과 db가 바뀔 때 마다 결과가 왜 다르지 아니겠습니까? 이 문제를 (어느정도)해결하지 않나 싶습니다.

꼼꼼하게 보지는 않았지만 현존하는 종 db들을 싹싹 털었던듯 싶네요

WoL(Web of Life), LTP(Living Tree Project)등의 db에서 확보가능한 full length 16S rRNA 서열을 긁어모았고 쿵짝 쿵짝 하고 taxonomy는 통일을 하기 위해 NCBI체계를 따르는 LTP 정보를 GTDB(Genome Taxonomy DataBase)에 통합하였다고 합니다.  curation차이로 인해서 LTP와 GTDB간의 차이가 발생하고 종의 종보들이 누락되어 있는 것들이 있다보니 데이터가 더 풍부한 GTDB에 LTP 정보들을 통합하였다고 하네요.
(개인적으로 NCBI taxonomy 체계를 사용하고 있는데...)

여튼.. 거의 10년만의 greengene의 귀환 논문이고 (단순히) 데이터만 많았던 siliva가 긴장좀 하겠네요 ㅎㅎ 

더 자세하게 읽어 봐야하는데...

기쁜 마음에 포스트 먼저 훗..

출처: @ye._.vely618

The next giant step for microbes

최근 페링과 세레스에서 개발한 C. difficile 관련 치료제가 FDA의 승은을.. 아니 승인 받은 미생물 치료제들이 세상에 나오고 있고, 최근에는 세레스에서 먹는 장내 미생물 치료제까지... ㄷㄷㄷ

그런의미에서 microbes관련 짧은 글 하나가 눈에 보여 살짝쿵 글하나 올려봅니다.

The next giant step for microbes

C. difficile 치료제가 FDA 승인을 받은 시점에서 microbes가 가야하는 그곳은 어디인가?

이제 다들 잘 알고 있다 싶이 장 속의 미생물을 비롯해서 피부, 구강, 질, 폐 등 다양한 기관 -다분히 청정 또는 무균 일 것이라고 생각되는 장기들-에 우리와 함께 살고 있는 수많은 미생물들이 있습니다.

그 중 장 속에 압도적으로 많은 다양하고 많은 미생물들이 존재하고 신경 발달과 약물에 대한 치료의 효과에도 영향을 미치고 있는 엄청 중요한 존재인것을 이제 연구를 통해 알아가고 있습니다.

그래서 많은 바이오 기업들이 장내미생물을 활용한 약물 또는 건강을 개선하는데 사용할 수 있는 보조제나 치료제들을 개발하기 위해 노력하고 있습니다.

그러나 아직 장내미생물이 건강에 지대하고 중요한 역할을 하는 것에 비해 알려진것이 생각보다 많진 않는것 같습니다. 또한 약물이나 치료제로써 사용하기 위해서 안전성도 중요한 문제이다 보니 이런 부분들에 대해서도 아직 갈길이 멀지만 그래도 또 걷다보면 좋은 일이 있지 않을까 합니다.

간만에 간략한 글 하나 공유해보았습니다.

세상에는 할일이 참 많다는 것은 변하지않는 진리인듯 합니다. :)

출처: @ye._.vely618

언제까지 primer3만 사용할텐가

이제부터는 ConsensusPrime을 사용해보자.

ConsensusPrime—A Bioinformatic Pipeline for Ideal Consensus Primer Design

https://github.com/mcollatz/ConsensusPrime

작년 말에 출판된 논문으로 서열 정렬과 프라이머 디자인까지 자동화한 tool 소개 곰국되겠습니다.

소스코드는 물론 최신 트렌드에 맞게 docker로도 제공되고있습니다.

primer를 디자인 하고자 하는 영역의 서열과 primer3의 paramerter 파일만 준비하면 나머지는 제가, 아니 ConsensusPrime가 해줍니다.

물론 내가 원하는 수준의 결과물이 나오냐? 그런 모르겠습니다만

그래도 온갖 삽질은 줄어 들것 같은 긍정회로가 돌아가고 있지 않나요? 

실제로 쓸만한지는 한번 사용해보는걸로 :)

다음에 흥미로운 논문으로 찾아오도록 하겠습니다.

@ye._.vely618

딥러닝을 이용해서 CRISPR/Cas9의 Off-Target Cleavage의 정확도를 보장할 수 있을까?

간만에 CRISPR/Cas9 off target 예측 툴하나 훑어보겠습니다.

biorxiv에 21년도에 오픈된 논문인데, 지금쯤이면 어디 안착했을거라고 생각했던 논문인데 아직 biorxiv에 있네요..

제목은 "piCRISPR: Physically Informed Deep Learning Models for CRISPR/Cas9 Off-Target Cleavage Prediction"

doi : https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.11.16.468799v3

github florianst/picrispr

유전자 편집에서 CRISPR/Cas9은 언급을 하지 않을 수 없는 기술이 됐죠

CRISPR/Cas9의 경우 기존 1,2세대 유전자 가위와 달리 target 서열을 인식하는 guide RNA만 있으면 어렵지 않게 유전자 편집을 할 수 있죠.

그러나 그와 함께 편집하고자 하는 위치를 정확히 하고자 하면 guide RNA의 길이가 길어질 수 밖에 없는데 guide RNA의 specific을 확보하기 위해 길이를 무한정 늘릴 수 없는 노릇이고, 사람 genome안에 흔하디 흔한 서열을 guide RNA 서열을 사용하게 되면 불필요한 곳을 편집하게 되니 guide RNA 서열을 잘 디자인 하는 것과 디자인한 guide RNA 서열이 off-target 없이 잘 작동하는지 미리 검토하는 작업이 필요하게 되었습니다.

그래서 유행하는 Deep Learning을 사용하여 CRISPR/Cas9의 off-target cleavage 정확도를 예측하는 툴을 만들었다고 합니다.

결론적으로,

동일한 guide RNA 서열이더라도 환경, 같은 사람이더라도 피부조직의 환경에서의 genome 또는 다양한 암(폐, 대장, 간...) 세포 내에서의 genome의 상황은 서로 다를 것이므로 이런 정보들을 잘 활용하여 CRISPR/Cas9 Off-Target의 cleavage의 예측 정확도를 향상 시켰고, 기존의 단순한 서열 기반의 off-target cleavage 예측 시스템과 다른 정확도를 보여줬다고 합니다.

모델은 6x23 모델과, 16x23 모델 2가지를 사용하였고,

서열정보와 더불어 GC Content, Nucleotide BDM, NuPoP Affinity, CRISPoff Free Energy 정보들을 활용하여 기존의 CRISPR/Cas9의 off-target 예측 툴 들과 비교하여 월등(?)한 결과를 보여줬다고 합니다.

그리고 Deep Learning종류 중 CNN(Convolutional Neural Network)와 RNN(Recurrent Neural Network) 방법이 있는데 결과를 비교 하다 보면 어떤 경우에는 CNN 방법이, 다른 경우에는 RNN 방법이 우수한 경우가 있었습니다. 이는 CNN과 RNN간의 우열이 있기 보다는 학습 방법의 특장점을 잘 활용해야 하는 것으로 보였고, 데이터의 특징에 따라 학습 모델을 잘 활용하면 조금 더 나은 결과를 확인 할 수 있지 않을까 합니다.

다음에 또 좋은 내용을 가지고 찾아오도록 하겠습니다. :)

@ye._.vely618

너도 AB1파일 가지고 pdf 만들 수 있어 (2)

너도 AB1 파일 사용해서 pdf 만들 수 있어 첫번째 글에 이은 두번째!!!

chatGPT한테 물어 물어 좀 쉽게 작성을 해보려고 했으나...

아.. 이것 또한 쉽지 않습니다.

예제를 보여줘서 학습을 시키면 좋을텐데... 잘 모르게서

그냥 간단히 matplotlib 코드만 간단히 활용해 보았습니다.

ab1 파일을 분석하는 것은 그냥 노가다로... ㅎㅎ 

우선 그냥 chatGPT한테 

"ab1파일 parsing해서 pdf로 만드는 스크립트 작성해줘" 하면 

from Bio import SeqIO

import matplotlib.pyplot as plt

# ab1 파일 경로 설정

abif_file = "example.ab1"

# ab1 파일 파싱하여 전기영동 결과 얻기

abif_record = SeqIO.read(abif_file, "abi")

electropherogram = abif_record.annotations['abif_raw']['DATA2']

# matplotlib를 이용하여 전기영동 결과 그래프 그리기

plt.plot(electropherogram)

plt.title("Electropherogram")

plt.xlabel("Base Position")

plt.ylabel("Signal Strength")

plt.show()

이렇게 알려줍니다.

이거 그대로 작성하면 우리가 기대했던 이미지하고 영 딴판의 결과가 저장됩니다.

그래서 세부 내용들은 Applied Biosystems에서 제공하는 Data File Format pdf를 좀 들쳐봐야합니다.

그래서 코드를 좀 수정 하면...

from Bio import SeqIO
import matplotlib.pyplot as plt

# ab1 파일 경로 설정
abif_file = "example.ab1"

# ab1 파일 파싱하여 전기영동 결과 얻기
abif_record = SeqIO.read(abif_file, "abi")
poc = record.annotations['abif_raw']['PLOC1']
a = record.annotations['abif_raw']['DATA10']
c = record.annotations['abif_raw']['DATA12']
g = record.annotations['abif_raw']['DATA9']
t = record.annotations['abif_raw']['DATA11']

data = {"A":a_seq, "C":c_seq,"G":g_seq,"T":t_seq}

plt.figure(figsize=(len(poc)/10,5))
for base, color in zip("ACGT",["g","b","k","r"]):
    plt.plot(data[base],color=color)

tmp = [None]*len(a_seq)

i=0
for pnt in poc:
    tmp[pnt]=seq[i]
    i+=1

plt.xticks(range(len(tmp)),tmp, fontsize=6)
plt.savefig('output.pdf')

이 코드를 사용하면 응? 좀 이상하지만 약간 그럴싸한 이미지가 보이실겁니다.

시퀀칭 업체에 Sanger Sequencing에 맡기면 fasta파일과 ab1파일과 함께 오는 pdf파일과 다르긴 하지만 얼추 비슷한...

그럼 다음 기회에는 Sanger Sequencing 맡기면 함께 받아 볼 수 있는 pdf 파일을 만들어보기로 해봐요. 내년 쯤에는 할 수 있지 않을까 합니다. :)

출처: @ye._.vely618

AAPL 1년치 주식 자료를 쉽게 다운로드 받을 수 없을까?

왜 없겠습니까?

그래서 chatGPT와 Bing에게 물어보았습니다.

chatGTP

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Q: https://finance.yahoo.com/ 에서 API를 이용해서 AAPL 주식 1년 자료 다운로드 받는 코드 짜줘.

A: 안녕하세요! Yahoo Finance API는 2017년 이후에 deprecated되어 더 이상 지원되지 않기 때문에, 이를 이용한 데이터 수집이 불가능합니다. 대신 Yahoo Finance에서는 다양한 주식 데이터를 제공하고 있으므로 다른 방법으로 데이터를 수집해야 합니다.

먼저, Python에서는 yfinance 라이브러리를 이용해서 Yahoo Finance에서 주식 데이터를 다운로드할 수 있습니다. yfinance를 사용하면 간편하게 주식 데이터를 다운로드할 수 있습니다. 아래는 yfinance 라이브러리를 이용해 AAPL의 1년치 주식 데이터를 다운로드하는 코드입니다.

import yfinance as yf

import datetime

start_date = datetime.datetime.now() - datetime.timedelta(days=365)

end_date = datetime.datetime.now()

# AAPL의 주식 데이터를 다운로드합니다.

aapl = yf.download("AAPL", start=start_date, end=end_date)

# CSV 파일로 저장합니다.

aapl.to_csv("AAPL.csv")

이 코드는 현재 날짜를 기준으로 1년 전부터 현재까지의 AAPL 주식 데이터를 다운로드하고, CSV 파일로 저장합니다. 위 코드에서 start_date와 end_date 변수를 변경함으로써 원하는 기간의 데이터를 다운로드할 수 있습니다.

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BING

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# yfinance 라이브러리 설치

pip install yfinance

# yfinance 라이브러리 임포트

import yfinance as yf

# AAPL 티커 객체 생성

aapl = yf.Ticker("AAPL")

# 1년 동안의 주가 데이터 가져오기

hist = aapl.history(period="1y")

# 데이터를 csv 파일로 저장하기

hist.to_csv("aapl_1y.csv")

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chatGTP와 bing에게 코드를 작성해 달라고 하였을 때 현재 단순한 코드에서는 chatGPT의 손을 들어주고 싶습니다.

그 이유는 date와 period의 차이라고 해두죠. 나중에 특정 년 월 일을 사용할 것을 생각한다면 bing보다는 chatGPT가 (아직은) 한 수 위 인듯 합니다. :)

출처: @ye._.vely618

논문을 내 의도에 맞게 쉽게 찾을 수 있을까

chatGPT나 Bing의 등장으로 저 같이 영어가 취약한(걍 저세상 수준) 닝겐들에게는 이제 논문 검색과 요약이 상대적으로 쉬워졌습니다.

물론 이미 구글 번역기만으로도 상당히 편했지만 이제는 더더더욱 좋아졌죠

그러나 이전에도 우리의 논문 검색을 도와주려는 시도는 있었습니다.

단지, 우리가 잘 몰랐을 뿐...

그래서 chatGPT의 시대가 찾아와서 조금 빛은 바랬으나
그래도 연구에 큰 도움이 누군가에게는되었을, 되고있을, 또 다른 연구주제의 시발점으로 활용 될 수 있을 논문 하나 투척 해봅니다.

이름하여 PubTator central automated concept annotation for biomedical full text articles, 이전 논문들 보니 이미 2013년도부터 작업은 하고 있었다고 합니다. (역시 제가 몰랐을 뿐)

URL: https://academic.oup.com/nar/article/47/W1/W587/5494727

DOI: doi.org/10.1093/nar/gkz389

간단히 얘기하면 PubMed의 초록정보와 PMC의 전문을 읽어서 gene, variant, disease 정보를 기준으로 tag를 달거나 annotation하여 내가 찾고자 하는 정보의 검색 결과 정확도를 향상시켜주는 검색 서비스라고 보시면 될듯합니다.

저자曰 pubtator은 문서 요약 서비스가 아니니 문서 요약을 원한다면 QuillBot Summarize라는 다른 툴을 사용하라고 안내하고 있네요. 친절도 하셔라 :)

그러나 2023년도를 사는 우리에게는 chatGPT, Bing이 있습니다.!! 

그럼 다음에는 또 다른 논문을 올려보기로 하겠습니다. :)

-Bing 요약 결과-

PubTator Central은 생물의학 전문 문서에 대한 자동 개념 주석을 제공하는 웹 서비스입니다. PubTator Central은 유전자/단백질, 유전 변이, 질병, 화학물질, 종 및 세포주와 같은 여러 중요한 생물 개념에 대한 최신 텍스트 마이닝 시스템의 주석을 제공하고 즉시 다운로드할 수 있습니다. PubTator Central은 PubMed(2천 9백만개 초록)과 PMC Text Mining subset(3백만개 전문 문서)을 주석 처리합니다. 새로운 PubTator Central 웹 인터페이스는 사용자가 전문 문서 컬렉션을 구축하고 각 문서에서 개념 주석을 시각화할 수 있게 해줍니다. 주석은 온라인 인터페이스, RESTful 웹 서비스 및 대량 FTP를 통해 여러 형식(XML, JSON 및 탭 구분)으로 다운로드할 수 있습니다. 개선된 개념 식별 시스템과 딥러닝 기반의 새로운 모호성 해소 모듈은 주석 정확도를 높이고 새로운 서버측 아키텍처는 속도를 크게 향상시킵니다. PubTator Central은 PubMed 및 PubMed Central과 동기화되며 매일 새로운 기사가 추가됩니다

출처: @ye._.vely618

우리가 기후변화에 더더욱 신경을 써야하는 이유

지속적으로 지구 온난화와 관련하여 과학자들이 주구장창 떠들어 데는데

겨울철 한파가 몰아칠 때 마다 이게 무슨 지구 온난화냐 한랭화 아니냐면서 지구 온난화라는 허구가지고 선동질 하는거 아니냐라는 정신없는 분들이 생각보다 많으나..

그런 분들은 차치하고 지구 온난화와 같은 기후변화에 우리가 신경써야 하는 이유에 대해서 언급한 논문이 최근에 출판되어서 하나 소개하려고 합니다.

Climate change and infectious disease: A prologue on multidisciplinary cooperation and predictive analytics

DOI: 10.3389/fpubh.2023.1018293

이 논문에서는 기후변화는 단순히 환경변화의 문제로 가뭄이나 홍수와 같은 이상기후로 인해 사람들이 피해를 입거나 식량의 생산량이 저하되어 기아 문제가 발생 하는 뿐 아니라 최근에 발병했던 COVID-19와 같은 전염병을 유발시켜 생물학적 보안에 문제가 발생 할 수 있다고 얘기하고 있고, 이런 문제들은 다제학적인 연구와 최근 각광받고 있는 AI/ML 방법을 이용하여 거시적으로 모니터링을 통해 예방해야한다 라고 얘기하고 있습니다.

다음은 저자가 환경에 영향을 받을거라고 생각하는(물론 환경, 특히나 기후변화만으로는 설명할 수 없을것이라고 이미 양념은 쳐놨습니다.) 전염병을 적어두었는데 매개체에 의해 일어나는 감염질환들 입니다.

Sin Nombre virus
Lyme Disease
Schistosomiasis
Malaria
Valley fever

기후변화, 즉 지구온난화로 이전에는 열대성 매개체들이 서식하지 못했던/않았던 지역들도 열대, 아열대 기후로 변하면서 해당 지역의 숙주(aka 인간)에게 감염이 용이해지거나 감염시킬 기회가 증가되서 적어둔듯 합니다.

가장 이해가 쉬운 시나리오는 갑작스런 강우로 홍수가 빈번하게 발생했는데 때마침 기온도 고온으로 유지될 때 홍수가 지나간 후 생긴 웅덩이에서 모기가 기하급수적으로 발생하고 그중 말라리아를 옮기는 모기들도 함께 증식되면서 말라리아가 잘 발생하지 않는 지역에 갑자기 말라리아가 발생하는 것이지 않을까 합니다.

그래서 게놈 연구도 중요하고 Vision연구도 중요하고 머신러닝과 AI를 이용한 기후와 질병 예측도 중요하고, 이 모든걸 혼자 할 수 없으니 공동 연구도 필요하다는 결론 되겠습니다.

그래서 이 논문도 Bing한테 한번 물어봤습니다.

논문 요약해줘

이 논문은 기후 변화와 감염병 사이의 관계에 대해 다학제적 협력과 예측 분석의 필요성을 강조하는 서론입니다. 저자들은 기후 변화가 감염병의 발생과 확산에 영향을 미치는 여러 요인들을 설명하고, 이를 예측하고 대응하기 위한 다양한 도구와 전략들을 소개합니다. 저자들은 기후 변화와 감염병의 복잡한 상호작용을 이해하고 관리하기 위해서는 과학자, 정책 결정자, 보건 전문가 등 다양한 이해관계자들이 협력해야 한다고 주장합니다.

기후변화가 감염병 발생과 관련이 있다고 했는데 genome 연구가 왜 중요한가요?

기후변화는 감염병의 발생과 확산에 영향을 미칠 수 있습니다. 기후변화로 인해 감염병의 범위나 계절성이 변하거나, 새로운 감염병이 등장할 수 있습니다. 기후변화는 200여 가지의 감염병과 수십 가지의 비전염성 질환에도 악영향을 미칩니다. Genome 연구는 이러한 기후변화와 감염병 사이의 관계를 이해하고 예방하고 치료하는데 도움이 될 수 있습니다. Genome 연구를 통해 감염원이나 전파 경로를 추적하거나, 적절한 백신이나 치료제를 개발하거나, 인간과 환경의 상호작용을 분석할 수 있습니다.

그럼 즐거운 주말 보내는걸로~ 제발~ 

출처: @ye._.vely618

 

임상에서 변이 탐지는 조금은 달라야지

오늘 읽어본 논문은 임상에서 변이탐지을 위한 모범 사례에 대한 내용입니다.

Best practices for variant calling in clinical sequencing

DOI: 10.1186/s13073-020-00791-w 

사실 지난번 논문이 현장에서는 더 도움이 되는 논문이긴 하나 

임상 현장에서의 의견이 좀 더 녹아져 있을까 해서 읽어보았습니다.

그래봤자 이미 우리 모두 대략적으로 다 알고 있는 바로 그 얘기입니다.

업으로 하고 있으신 들이 보면 사실 새로운건 없어요. 그냥 레퍼런스에요

어떤 정렬 프로그램이 좋은지, 정렬 하고 나서 바로 변이 탐지를 해도 되는지, 아니면 전처리를 어떻게 하고 변이 탐지를 하면 좋은지, 어떤 변이 탐지 방법을 사용하는게 좋은지..

여기서는 GATK 모범 사례를 주로 들긴 했지만, 여러 변이 탐지 프로그램 사용해서 가급적 못잡는 변이를 최소화하고, 가끔 de-novo 변이가 있는데 그거는 나도 모르겠으니 IGV 키고 눈씻고 찾아봐라. CNV도 시중에 떠돌아 다니는 프로그램 사용하더라도 마지막에는 IGV켜서 확인해라.

인듯하네요.

그리고 다음 내용은 MS사의 Bing에게 "요약해줘"(균형있게) 치트키를 써서 나온 내용입니다.

이 논문은 유전 질환과 암과 같은 질병에 대한 임상 유전 검사에서 사용되는 차세대 시퀀싱 기술의 발전에 따라 정확한 변이 호출이 얼마나 중요한지를 설명합니다. 또한 현재 변이 호출에 대한 최선의 관행과 향후 개선 방향을 제시합니다.

답변 후 요약이 충분히 도움이 되었나요? 더 자세한 정보를 원하시면 말씀해달라고 해서, "아니오, 더 자세히 알고 싶어요" 해서 나온 내용은 아래와 같습니다.

논문은 다음과 같은 내용으로 구성되어 있습니다.

배경: 차세대 시퀀싱(NGS) 기술은 임상 유전 검사의 범위와 정확도를 크게 향상시켰습니다. 그러나 NGS 데이터에서 변이를 호출하는 과정은 여전히 복잡하고 오류가 발생하기 쉽습니다. 따라서 변이 호출에 대한 표준화된 가이드라인과 최적화된 파이프라인이 필요합니다.

본론: 논문에서는 NGS 데이터에서 변이를 호출하는 과정에 영향을 미치는 여러 요인들을 설명합니다. 예를 들어, 시퀀싱 플랫폼, 시료 준비 방법, 분석 소프트웨어 등입니다. 또한 현재 사용되고 있는 변이 호출 알고리즘과 도구들을 비교하고 평가합니다. 마지막으로 임상 유전 검사에서 변이 호출의 정확도와 신뢰도를 향상시키기 위한 권장 사항과 개선 방안을 제시합니다.

결론: NGS 기술은 임상 유전 검사의 혁신적인 도구입니다. 그러나 변이 호출은 여전히 어려운 문제입니다. 이 논문은 임상 유전 검사에서 변이 호출에 대한 최선의 관행과 향후 연구 방향을 제공합니다.

더 궁금하신 점이 있으신가요?🙋

다음은 chatGPT한테 요약해줘 한 내용

이 논문은 기존 유전체 연구를 보완하고, 유전체 변이를 활용하여 질병 진단과 치료 방법을 개선하는 것을 목적으로 하고 있다.

이 논문에서는 유전체 연구의 새로운 방법으로 'CRISPR-Cas9' 기술을 사용하여 질병 관련 유전자를 수정하는 방법을 제시한다.

chatGPT는 참 치명적으로 창의적인듯...

결론은 chatGPT한테 링크 알려주고 요약해줘하면 헛소리 작렬, MS Bing한테 링크 알려주고 요약해줘 하면 성심껏 알려주는 거기다가 답변도 창의적으로, 균형있게, 근거기반 세분화해서 알려주는게 포인트

@ye._.vely618

역시 변이 탐지에서도 machine learning

역시 세상에는 내마을을 알고 있는 분들이 있다는..

논문 제목은 Systematic benchmark of state-of-the-art variant calling pipelines identifies major factors affecting accuracy of coding sequence variant discovery 입니다.

doi: https://doi.org/10.1186/s12864-022-08365-3

결론은 누가누가 변이를 잘 찾나 테스트 되겠습니다.

그래서 샘플 준비도 GIAB과 함께 non-GIAB 데이터도 준비하고, 정렬 프로그램도 BWA, BOWTIE, Isaac, Novoalign 다양하게, 변이 caller도 GATK, FreeBayes, Strelka이외에도 DeepVariant나 Clair3와 Octopus 등 다양한 변이 caller를 도입해서 테스트를 진행해 보았다고 합니다.

Clair3와  Octopus는 처음들어 봤네요 @.@ 역시 사람은 공부를 해야함

그리고 GIAB외에도 non-GIAB 데이터를 활용한것은 또 새로운 접근법인듯합니다. 아무래도 많은 연구가 이뤄진 데이터와 그러지 않은 데이터간의 차이가 있을 수 있고, 아직 T2T를 사용한 변이 탐지 벤치마킹 논문을 찾아보진 못했는데 이 또한 조만간 나오겠네요. 이미 나와 있을수도.. 

여튼 이것저것 따져 봤을 때 정렬 프로그램은 일단 Bowtie2는 성능이 저하되는 결과를 보여주기에 사용하면 안되는 방법이고, 변이 탐지에서는 DeepVariant가 좋은 성능을 보이는 결과를 얻을 수 있었다고 합니다.

그리고 GIAB와 non-GIAB 샘플을 비교해본 바 현재 사용하는 분석 방법이 GIAB에서만 좋은 결과를 보이고 non-GIAB에서는 그렇지 않다는 것, aka GIAB 샘플이나 non-GIAB 샘플이나 편견없이 잘 분석된니, 현재 분석 방법들을 활용해도 문제가 없다는 것을 확인하였다고 합니다.

그러나 아직 존재하는 몇 가지 문제점을 지적하기도 했습니다.

기계학습 방법을 사용하는 caller 같은 경우 모델에 따라 변이 탐지에 문제가 발생할 수 있기 때문에 조심해서 사용하여야 하고, 앞서 얘기했던 T2T 표준 유전체를 사용하였을 때 발생할 수 있는 기존 정렬 프로그램이나 변이 탐지 프로그램의 한계점이나 영향(부정적인)은 확인된바가 없기떄문에 검토가 필요하다는 점, GIAB이나 non-GIAB이던 일반적인 벤치마킹에 사용하고 있는 표준 샘플들의 사용 region에 대한 문제, 대게 잘 정의된 변이들은 유전자 영역에 분포하고 있기 때문에 비유전자 영역에 있는 변이 또는 시퀀싱이 잘 되지 않은 영역들에 대한 정보는 제한적일 수 있기에 이런 단점들이 보강된 표준 샘플들이 필요하는 점, NGS 데이터의 경우 지속적으로 개선되고 새로운 방법이나 도구들이 개발되고 있으나 민감도, 재현성과 같은 변이 탐지 성능 지표에 집중되어 있지 분석 시간이나 사용의 편의성, 프로그램 설치 난이도와 같은 비교적 중요하게 다루지 않는 항목들에 대해서도 관심이 필요하다는 것들에 대해서 언급을 해주었습니다. 

간만에 최신 변이 탐지 벤치마킹 논문을 한번 읽어봤는데, 저는 유익한 시간이었는데 어떠셨나요? 

이제 즐거운 주말을 보내러~ :)

ps. 근데 chatGPT한테 요약 해달라고 하니 왜 이 논문에서 Dama dama (사슴)을 왜 그리 찾는지... 처음에는 내가 url을 잘못 입력한줄 알았는데... 

출처: @ye._.vely618

언제나 인간이 선을 넘었지, 바이러스가 선을 넘진 않았지

지난 2월 16일 Genomeweb와 cell지에 무시무시한 뉴스 한편이...

말레이 천산갑에서 HKU4-CoV보다 더 넓은 숙주를 감염시킬 수 있는 MjHKU4r-Cov라는 새로운 MERS와 유사한 CoV가 있다는 것이 확인되었다고 합니다.

ㅎㄷㄷㄷㄷ 

GenomeWeb 기사는 제가 회원이 아니라 모르겠고 공개되어 있는 cell의 논문이나 가볍게 읽어 보았습니다.

"A bat MERS-like coronavirus circulates in pangolins and utilizes human DPP4 and host proteases for cell entry"의 논문으로, 모든 면에서 "가볍"게 읽었습니다. (진지하게 받아들이셔도 개취 존중)

일단 또 Pangolin, 천산갑이 등장했습니다. 
천산갑이 매개자 역할을 하는 것인지 명확하지 않지만(저말고 이 곰국저자 曰) 포유류중 가장 많이 밀매된다고 코로나로는 부족했나 봅니다.

여튼 맛이 좋은건지, 한약재로 인기가 좋은건지 모르겠지만 Malayan pangolins, 말레이 천산갑에서 새로운 MERS-like coronavirus (이하 MjHKU4r-CoV)를 86마리(이 말레이 천산갑은 어디서 구했는지 모르겠으나) 천산갑 중 4마리는 pan-CoV PCR 양성, 7마리는 혈청 양성 반응을 보였고, 시퀀싱을 하여서 4개의 바이러스 서열을 확보, 이중에서 MjHKU4r-CoV 서열도 함께 확보해서 이런저런 실험을 진행해보았다고 합니다.

그래서 천산갑에서 확인된 새로운 바이러스가 사람도 감염시킬 수 있는가?

MjHKU4r-CoV는 사람을 감염시킬 수 있는가? 어려운 실험얘기는 논문 보시면 알 수 있고, HKU4-CoV, MERS-CoV, MjHKU4r-CoV를 가지고 실험을 해 보았다고 합니다.

근데 왜 MjHKU4r-CoV의 감염력 실험을 하는데 다른 2개 바이러스는 왜 할까? HKU4-CoV는 박쥐 코로나바이러스로 사람에게 직접 감염이 어려운 바이러스(음성컨트롤)이고, MERS는 MERS는 이미 사람에게 감염되는 것으로 알려져있죠(양성컨트롤)? 논문 제목과 새로운 바이러스의 이름때문에 박쥐(HKU)와 MERS를 비교삼아 진짜 감염력이 있는지 어느 녀석과 감염력이 유사한지 확인해본겁니다. 

그래서 결론은 사람 너님은 잘 감염됨. 또한 ACE2와 비슷한 hDPP4 또한 중요하다는 것도 확인했고 DPP4라는 수용체를 바탕으로 숙주가 가능한 것들을 한번 테스트 해봤는데.. 돼지, 염소, 고양이, 토끼, 말, 쥐, 햄스터, 개와 같이 감염시킬 수 있는 숙주의 범위가 꽤나 넓습니다.

근데 지난번에 우리 COVID19에 사용할 수 있는 치료제 있다고 하지 않았나?

예, 음.. 정확히 COVID19에 사용하기 위한 치료제는 모르겠고 에볼라 치료를 위해 만들었던 Remdesivir가 COVID19에도 효과가 있다고는 알려져 있어 사용해보았고 추가적으로 무엇인지는 모르겠으나 GC376, EIDD-2801라는 물질도 MjHKU4r-CoV에 효과가 있는지 확인해보았다고 합니다.

다행히 바이러스의 복제를 억제하는 효과는 있는것으로보입니다(Fig 7).
다만 MjHKU4r-CoV와 함께 MERS는 했으면서 왜 SARS-CoV는 왜 안했지.. 조금 궁금하네요..
그리고 억제 효과가 1uM이하에서는 안보이기 시작하는데.. 실제 주사로 투여했을 때 1uM이라는 수준으로 약제가 잘 도착해야할텐데... 

무튼... 

연구의 한계점이 있다는 것을 밝히면서 마무리하고 있는데, 삼림채벌이나 야생동물의 무분별하게(비위생적으로) 거래되어 애초에 인간과 접촉할 일이 없었던 바이러스들이 인간과 많이 접촉하게 되어 문제가 되고 있으니 적극적인 감시와 모니터링이 필요하다고하면서 논문을 마무리하였습니다.

천산갑에서 또 다른 COVID19와 유사한 바이러스가 또 나와서 COVID19와 같은 피해와 슬픔을 또 줄 수 있으니 두려움이 생길 수 있으나 아직은 가능성에 대한 내용일 뿐 지금부터 잘 대처하고 준비하면 COVID19 때 보다는 나은 상황이 펼쳐지지 않을까 하는 기대를 가져봅니다.

출처 : @ye._.vely618