Widespread Polycistronic Transcripts in Fungi Revealed by Single-Molecule mRNA Sequencing

Widespread Polycistronic Transcripts in Fungi Revealed by Single-Molecule mRNA Sequencing

간만에 읽은 저널 한편...
어느 지구정복을 꿈꾸시는 과학자분께서 운영하시는 것에 비하면 그냥 트윗터 수준임을
미리 알려드립니다.

자세히 안파해칩니다.

필요한것만 읽습니다.(제목만 보고 대충 때려맞추겠다는 심본데? 정답!!)

곰팡이중 basidiomycete fungi를 Iso-Seq을 이용하여 transcriptome 분석을 수행하였고, 우리는 기존의 short read가지고 깨작대던 님들이 못찾는거 찾는 기승전시퀀싱자랑하는 논문되겠습니다.

일단 이 논문은 JGI와 Pac이 손잡고 만들었습니다.
이 말은 곧 SMRT 비용 신경안쓰고(는 아니고 다른 연구자들보다 적게 신경썪을..) 분석에 사용하기 좋은 고 퀄러티 read들을 넉넉히 생산했을 것이기에 이런거 하고 싶다고 그냥 무작정 논문에 나온 SMRT cell 만큼 시퀀싱하시면 거지꼴 못면합니다.
suppl보시면 아시겠지만 SMRT cell 두자릿수 입니다. 앞자리가 10이 아닌건 안비밀 Orz..

복잡하고 어려운거 직접 보시면되니깐 쉬운거 말씀드리고 끝내겠습니다.

기존에 분석한 basidiomycete fungi중 Plicaturopsis crispa를 집중으로 파해쳤는데 이전까지 알고 있는 isoform 비율 10%가 아닌 한 20%정도 된다. 그리고 곰팡이도 isoform 3개 이상짜리도 엄청 많이 있음. 우리 곰팡이 무시하지 마셈.

그리고 비교셋으로 일루미나 숏-리드도 시퀀싱해서 ToFU (Transcript isOforms: Full-length and Unassemble,의 약자로 iso-seq을 분석하는 파이프라인? 시퀀싱 전략? iso-seq 결과물? 논문 보시면 아시겠지만 다양하게 사용되는것을 알수 있음)와 비교해봤는데
기승전 풉 짧은 것들은 안됨.
(하..... 지금까지 짧은것가지고 한것도 서러운데.....  ㅠ.ㅜㅋ)

여튼.. 모 검증은 해봐야하는거고 이 논문에는 RT-PCR해서 polycistronic 검증을 하긴했는데 좀더 확인해봐야 할것 같고..
새로운것 찾았다고 하고싶은 분들은 Iso-Seq 관심가지고 해보시는것도 나쁘지 않을것 같습니다.

근데 왜 너는 PacBio 관계자도 아니면서 PacBio로 실험한 논문 소개 하냐?

제 비록 제가 몸담고 있는 곳에는 PacBio가 주력이 아니지만
저는 언제나 연구자분들이 좀더 멋진 연구를 하실수 있도록 아낌없이
조언을 해드리고자 고심하는 연구자아니깐요 (캬~ 멋있다)

InterProScan Error를 대하는 방법

근래 interproscan을 돌리는데
어떤 옵션은 문제없이 작업이 진행되는데
어떤 옵션은 작업중에 주구장창 에러만 뱉어내서
내가 무엇을 잘못하는지 어리둥절하고 있었는데 은근 쉬운 문제였다는...

우선 제가 하는 작업은

1) interproscan.sh -i input.fa -appl pfam -f tsv
2) interproscan.sh -i input.fa -goterms -f tsv

1)번 command는 문제업이 계속 잘 진행
2)번 command는 미친듯이 자바에러를... ㅠ.ㅜ

그런데 역시나 그렇듯이
에러를 자세히 보면 해결할 수 있다는 :)
(문제속에 답이 있다는 드립은 아니고;; )

제가 겪은 오류의 문제는 hostname 설정만 해주면 된다는 사실
이유는 -iprlookup 때문인데.. Host를 찾을 수 없어서 쉰나게 에러를(아이 씬나~ )
그래서 /etc/hosts에 127.0.0.1에 그냥 알아서 잘 추가해주면 된답니다.

interproscan 돌리실때 에러난다고 속상해하지 마시고
에러를 잘 확인하시면 그 속에 길이 있을수 있습니다.
ps. 세그먼트 폴트가 난다면 그냥 때려치우세요..

Kmer 분석 관련 논문

간만에 뒤적이다가 Kmer 관련해서 설명된 2013년도 논문이 있어서 아실분은 아시겠지만
공유차 끄적끄적 합니다.

Estimation of genomic characteristics by analyzing kmer frequency in de novo genome projects

논문요약을 하자면

NGS의 발전으로 re-seq말고도 de novo를 하는데 short read라서 우리가 genome assembly를 잘했는지 "아 몰라요" 하지 않기위해 서열의 content frequency를 사용해서 예측하는 k-mer 분석을 해서 대략적으로라도 genome size를 확인해서 우리가 "assembly 쩔 잘했어요"를 외치는데 도움이 되는 테스트도 해봤고 소스도 있습니다. 우리 잘했죠?

모 그런 내용 되겠습니다. :)

가장맘에 들었던 figure는 error와 heterozygous에따른 Kmer 분포 였습니다.


NGS 특히 일루미나 데이터를 가지고 de novo 해보셨던 분들께서는
아마 다음과 같은 그림을 보셨을겁니다.

맨날 보는 그림이고 이그림은 시퀀싱 error를 포함하고 있는 그림입니다(1-2 depth에 peak가 무제한인게 가당키냐 한 얘기냐고요 >_< ).

다음이 이상적인 시퀀싱이 된 결과 에서 얻어질수 있는 원래 kmer 그래프 입니다(이것도 가당키나 가능한 얘기냐??).

그리고 하단의 그림은 위의 그림들을 merge하여 잘 표현해놓은 그림입니다.

그리고 마지막으로 Kmer분석하면 진짜 genome size 예측 제대로 되는거 맞어?
라는 의구심을 가지시는 분들께서는 논문 p25에 Table2. b 테이블보시면 되겠습니다.

현재 genome size가 보고된 종들에 대해서 Kmer분석을 해봤고, 어떻게 하면 그나마 실제 genome size에 가까운 Kmer 분석 결과를 얻을 수 있는지 아실수 있습니다. 그리고 보시다 싶이 genome size큰거는 (사람은 150Mb 차이가 나는데) 예측 잘 안되는거 아니냐 라고 할수 있지만 %로 보면 오차가 5%내외이니 크게 걱정하지 않으셔도 됩니다(아마추어 같이 왜그러십니까).

그리고 논문 마지막에 K-mer 분석하려면 (인간적으로) genome size에 30x 이상은 시퀀싱하자 라고 촉구하고 있습니다.

사족: 논문 맹신하지 말아라. 겪어보면 알겠지만 케바케다.