RNA-Seq 데이터로 SNP를 찾아내보자 -2-

오늘 논문은 2019년에 출판된 RNA-seq데이터로 SNP를 발굴하는 방법에 대한 논문입니다. 제목은 A high-throughput SNP discovery strategy for RNA-seq data 으로 이전에 포스팅은 새로운 tool을 만들어서 자랑을 했다면 이번 논문은 기존에 사용하던 tool들을 조합해서 식물에서 생산한 RNA-seq 데이터에서 SNP를 발굴하는 방법을 테스트 한 논문되겠습니다.

DOI: 10.1186/s12864-019-5533-4



gemini

## RNA-seq 데이터로 유전자의 차이를 찾는 방법
이 파일은 RNA-seq 데이터에서 SNP를 찾는 효율적인 방법을 제시하는 논문입니다. 좀 더 쉽게 말하면, 유전자 활동 정보를 이용해 사람들 간의 유전적 차이를 정확하게 찾아내는 방법을 연구한 것이죠. 마치 돋보기로 숨은 그림을 찾는 것처럼, RNA-seq 데이터를 활용하면 DNA 염기서열의 미세한 차이까지 찾아낼 수 있습니다.
### SNP가 뭐길래? 🤔
사람마다 얼굴 생김새가 다르듯, 유전 정보도 조금씩 다릅니다. 이러한 차이를 만드는 요인 중 하나가 바로 **SNP(단일 염기 다형성)**입니다. SNP는 DNA 염기서열에서 단 하나의 염기가 다른 것을 말하는데, 이 작은 차이가 키, 눈 색깔, 질병 발생 가능성 등 다양한 특징을 만듭니다.
### RNA-seq 데이터로 SNP를 찾는 방법 🧐
* **RNA-seq**: 세포 내에서 활동하는 유전자 정보를 담고 있는 RNA를 분석하는 기술입니다.
* **어셈블러**: RNA-seq 데이터를 조각조각 모아서 전체 유전 정보를 재구성하는 프로그램입니다. 마치 퍼즐 조각을 맞추는 것과 같습니다.
* **SNP 콜러**: 재구성된 유전 정보에서 SNP를 찾아내는 프로그램입니다. 숨은 그림 찾기 전문가라고 할 수 있죠.
### 이 논문에서 무엇을 했나요? 🤔
* **다양한 조합을 테스트**: 연구진들은 여러 종류의 어셈블러와 SNP 콜러를 조합하여 어떤 조합이 SNP를 가장 정확하게 찾아내는지 실험했습니다.
* **최적의 조합 발견**: 실험 결과, **Trinity 어셈블러**와 **GATK SNP 콜러**를 함께 사용하는 것이 가장 정확했습니다. 특히, 150bp 길이의 paired-end read를 사용했을 때 복숭아와 귤에서 100% 정확도로 SNP를 찾아냈습니다.
* **새로운 가능성 제시**: 이 연구는 RNA-seq 데이터를 이용하여 SNP를 정확하게 찾아내는 효율적인 방법을 제시했습니다. 이는 다양한 생물의 유전 정보를 분석하고, 질병 예측 및 개인 맞춤형 치료 등에 활용될 수 있습니다.
### 왜 이 연구가 중요한가요? 🤔
* **질병 예측 및 맞춤형 치료**: SNP는 질병 발생 가능성이나 약물 반응성과 관련이 있습니다. SNP 정보를 활용하면 개인별 질병 위험도를 예측하고, 가장 효과적인 치료법을 선택할 수 있습니다.
* **유전자 연구 발전**: RNA-seq 데이터를 이용한 SNP 분석은 유전자 연구의 새로운 도구가 될 수 있습니다. 이를 통해 유전자의 기능과 질병과의 관계를 밝혀내고, 새로운 치료법 개발에 기여할 수 있습니다.
### 결론
이 논문은 RNA-seq 데이터를 이용하여 SNP를 효율적으로 찾아내는 방법을 제시하는 중요한 연구입니다. 이 연구는 유전자 연구의 발전과 개인 맞춤형 의료 시대를 앞당기는 데 크게 기여할 것으로 기대됩니다.

clova-x

생명체의 유전 정보는 DNA에 저장되어 있으며, 이 DNA는 A, T, C, G라는 네 가지 염기로 구성되어 있습니다. 이 중에서 하나의 염기가 다른 염기로 바뀌는 것을 SNP(단일 염기 변이)라고 하며, 이는 유전적 다양성을 만들어내는 원인 중 하나입니다.
SNP는 유전 질환, 암, 당뇨병 등 다양한 질병과 관련이 있으며, 작물의 생산량, 품질, 병 저항성 등에도 영향을 미칩니다. 따라서, SNP를 탐지하고 분석하는 것은 생명공학 분야에서 매우 중요한 과제 중 하나입니다.
최근에는 NGS(차세대 시퀀싱) 기술이 발전하면서, 빠르고 대규모로 SNP를 탐지할 수 있게 되었습니다. 대표적인 NGS 기술로는 Illumina Genome Analyzer, Roche/454 FLX, ABI SOLiD 등이 있으며, 각각의 플랫폼은 민감도, 정확도, 재현성, 처리량 등에서 차이가 있습니다.
RNA-seq(RNA 시퀀싱)는 유전자의 발현을 분석하는 데 사용되는 기술로, 이를 통해 SNP를 탐지할 수도 있습니다. RNA-seq 데이터를 분석하여 얻은 서열 정보를 바탕으로 SNP를 찾아내고, 이를 통해 유전자의 기능과 발현 패턴을 이해할 수 있습니다.
하지만, RNA-seq 데이터에서 SNP를 탐지하는 것은 여러 가지 어려움이 있습니다. 데이터의 양이 많고 복잡하며, 누락되거나 오류가 있는 데이터가 있을 수 있습니다. 또한, SNP를 탐지하는 데 사용되는 알고리즘과 도구도 다양하며, 각각의 장단점이 있습니다.
따라서, RNA-seq 데이터에서 SNP를 탐지할 때는 적절한 알고리즘과 도구를 선택하고, 데이터를 정제하고 검증하는 과정이 필요합니다. 이를 위해 다양한 어셈블러와 SNP 콜러를 비교하고, 최적의 조합을 찾아내야 합니다.
예를 들어, Trinity와 GATK는 RNA-seq 데이터에서 SNP를 탐지하는 데 널리 사용되는 어셈블러와 SNP 콜러입니다. 이들은 높은 정확도와 재현성을 제공하며, 다양한 생물종에서 성공적으로 사용되었습니다.
또한, read 길이도 SNP 탐지의 정확도에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 긴 read 길이는 더 많은 정보를 제공하여 SNP 탐지의 정확도를 높일 수 있습니다.
이러한 기술과 전략을 활용하여 RNA-seq 데이터에서 SNP를 탐지하고 분석함으로써, 유전자의 기능과 생물학적 과정을 이해하고, 질병의 진단과 치료, 작물의 육종 등에 활용할 수 있습니다.

chatGPT

**고빈도 RNA-seq 데이터에서 SNP 탐지 방법**
### 1. SNP란 무엇인가요?
SNP(단일 염기 다형성)는 DNA 서열에서 하나의 염기가 다른 염기로 바뀐 유전자 변이를 뜻합니다. 예를 들어, DNA 서열 중 특정 위치에서 원래 ‘A’(아데닌)였던 염기가 ‘G’(구아닌)로 변한 경우가 있습니다. 이러한 변이들이 여러 곳에서 쌓이면, 개체들 간의 유전자 차이를 형성하고, 생물의 특징이나 질병 발생과 연관될 수 있습니다.
SNP는 유전적 다양성을 나타내는 중요한 지표로, 유전자 연구와 질병 진단 및 예측, 품종 개량 등의 연구에서 널리 사용됩니다.
### 2. RNA-seq 데이터로 SNP를 탐지하는 이유는 무엇인가요?
RNA-seq는 RNA(전사체)를 시퀀싱하여 유전자 발현 수준을 파악하는 기술입니다. 이 데이터는 많은 양의 변이를 포함하고 있어 SNP를 찾는 데 적합합니다. RNA-seq 데이터로 SNP를 분석하면 단백질 생성에 영향을 미치는 유전자 변이를 발견할 수 있어, 농업, 질병 연구, 신약 개발 등에서 활용도가 큽니다.
### 3. RNA-seq 데이터에서 SNP를 찾는 과정
SNP를 발견하는 과정은 RNA-seq 데이터에서 원시 데이터를 수집하고 이를 분석해 유의미한 변이를 찾는 절차로 이루어집니다. 이번 연구에서는 다음과 같은 조합으로 RNA-seq 데이터를 분석하여 가장 높은 정확도의 SNP 탐지 방법을 찾았습니다:
- **리드 길이:** 125 bp 또는 150 bp
- **조립 프로그램(Assembler):** Trinity, IDBA, oases, SOAPdenovo, Trans-abyss
- **SNP 탐지 프로그램(SNP Caller):** GATK, GBS
### 4. 연구에서 발견한 최적의 방법
이 연구는 복숭아와 귤의 유전자를 대상으로 실험하여 가장 높은 정확도를 보이는 방법을 찾아냈습니다. 특히, **150 bp의 리드 길이, Trinity 조립 프로그램, GATK 탐지 프로그램**을 사용할 때 SNP 탐지 정확도가 100%에 이르렀습니다. 이 조합이 다른 조합들에 비해 훨씬 높은 정확도를 나타내어, 다양한 식물과 생물의 SNP 연구에 사용할 수 있는 이상적인 방법으로 제시되었습니다.
### 5. 연구 결과와 의미
이 연구의 결과는 특정 조합을 사용했을 때 SNP를 빠르고 정확하게 찾을 수 있음을 보여주었으며, 특히 RNA-seq 데이터를 이용해 유전자 변이를 분석하는 과정에서 큰 도움을 줄 수 있습니다. 이는 향후 품종 개량, 질병 유전자 연구 등에서 효과적인 방법으로 활용될 수 있을 것입니다.

NotebookLM

## RNA 염기서열 데이터에서 SNP를 찾는 방법: 복숭아와 귤을 이용한 연구
안녕하세요, 저는 RNA 염기서열 데이터에서 SNP를 찾는 방법을 연구하는 전문가입니다. 오늘은 생명공학을 전공하지 않은 일반인 분들을 위해 "s12864-019-5533-4.pdf" 파일의 내용을 쉽게 설명해 드리려고 합니다. 복숭아와 귤의 RNA 염기서열 데이터를 이용한 이 연구는 어떻게 하면 **SNP를 정확하게 찾아낼 수 있는지**에 대한 흥미로운 결과를 보여줍니다.
### 1. SNP란 무엇인가요?
**SNP는 '단일 염기 다형성'의 약자로, DNA 염기서열에서 단 하나의 염기가 다른 것을 의미합니다.** 마치 길고 복잡한 문장에서 한 글자만 다른 것과 같죠. 사람마다 DNA 염기서열이 조금씩 다른데, 이러한 차이를 만들어내는 주요 요인 중 하나가 바로 SNP입니다. SNP는 유전형질, 질병 발생 가능성, 약물 반응 등에 영향을 줄 수 있습니다.
### 2. RNA 염기서열 데이터를 이용하면 왜 SNP를 찾기 쉬울까요?
**RNA 염기서열 분석(RNA-seq) 기술**은 DNA 염기서열 분석보다 저렴하면서도 유전자의 기능과 발현에 대한 정보를 풍부하게 제공합니다. RNA-seq를 통해 **수천 개의 SNP를 한 번에 발견**할 수 있으며, **특정 유전자의 발현량**까지 알 수 있다는 장점이 있습니다.
### 3. 연구는 어떻게 진행되었나요?
* **복숭아** 품종 'Hujingmilu'와 'Yulu', **귤** 품종 'Ponkan'과 'Yellowish-peeled Ponkan'의 껍질 조직에서 RNA를 추출하여 RNA-seq 데이터를 얻었습니다.
* **두 가지 길이의 염기서열 데이터(125 bp, 150 bp)**, **다섯 가지 조합기(Trinity, IDBA, Oases, SOAPdenovo, Trans-ABySS)**, **두 가지 SNP 호출기(GATK, GBS)**를 다양하게 조합하여 SNP를 예측했습니다.
* 예측된 SNP를 **PCR 증폭, 유전자 클로닝 및 염기서열 분석**을 통해 얻은 실제 SNP와 비교하여 정확도를 평가했습니다.
### 4. 연구 결과는 무엇인가요?
* **150 bp 길이의 염기서열 데이터를 사용했을 때 125 bp에 비해 잘못된 SNP(false positive SNP)를 찾는 비율이 훨씬 낮았습니다**.
* **조합기 중에서는 Trinity**가 가장 우수한 성능을 보였고, **SNP 호출기 중에서는 GATK**가 GBS보다 실제 SNP를 놓치는 비율이 낮아 훨씬 우수했습니다.
* **150 bp 길이의 염기서열 데이터, Trinity 조합기, GATK SNP 호출기**를 함께 사용했을 때 복숭아와 귤에서 모두 **100%의 정확도**로 SNP를 찾아낼 수 있었습니다.
### 5. 이 연구가 왜 중요한가요?
이 연구는 **RNA-seq 데이터에서 SNP를 정확하고 효율적으로 찾아내는 최적의 방법을 제시**했다는 점에서 큰 의미가 있습니다. 150 bp 길이의 염기서열 데이터, Trinity 조합기, GATK SNP 호출기 조합은 복숭아와 귤뿐만 아니라 다른 생물에도 적용 가능할 것으로 기대됩니다.
### 6. 이 연구 결과는 어떻게 활용될 수 있을까요?
**SNP는 유전적 다양성 분석, 품종 개량, 유전체 연관 분석 등 다양한 분야에서 활용될 수 있습니다.** 예를 들어, 특정 질병에 대한 저항성을 가진 품종을 개발하거나 개인별 맞춤형 의료 서비스를 제공하는 데 유용하게 활용될 수 있습니다.

식물 중에 복숭아와 귤(만다린)을 가지고 테스트 했을 때 Trinity와 GATK로 SNP를 탐지하면 가장 좋은 결과 (확인된 280개 SNP 모두 탐지!!)를 보여줬고, 그 외 조합으로는 정확도가 100%에 도달하지 못했다고 하니, Reference Genome가 없는 경우 Paired-end RNA-seq 데이터만 있다면 Trinity와 GATK로 SNP를 탐지하면 쓸만한 결과를 얻을 수 있지 않을까 합니다. ;)

요즘엔 걍 이런 논문 찾지 말고 perplexity, chatGPT, gemini 한테 분석 전략을 문의하는게 더 정확하고 빠를지도.. 물론 팩트체크는 필수입니다만 ㅎㅎ

출처: @ye._.vely618

SpeedSeq은 어디에 쓰는거지?

오늘은 연식은 좀 되었으나 빠른 분석 tool하나 가져와봤습니다.


SpeedSeq: ultra-fast personal genome analysis and interpretation

doi : 10.1038/nmeth.3505

이름하여 SpeedSeq!! 그래서 제목에 ultra-fast, 초고속이 들어갑니다.
근데... 분석시간이 얼마나 걸렸었는지는.. 기억이 잘..

논문에서는 저렴한 서버에서 50x WGS데이터를 13시간만에 align을 했다고하는데...
(저렴한서버의 정의는 CPU 16core에 128GB RAM이 장착된 서버라고 하네요)

여튼 논문에서는 50x WGS 데이터를 저렴한 서버를 사용해서 분석을 진행할 때 정렬 작업을 시간단위에서 끝냈다.. 라는 소식을 솔직히 DRAGEN 제외하고서는 들어본적이 없어서 조금 갸우뚱 하긴 합니다.

여하튼 논문에서 13시간만에 정렬을 끝냈다고 했다니!! 그렇다고 믿는게 인지상정 아니겠습니까?

근데 정렬 속도가 빠른건 큰 장점이지만 단순히 속도만 빠르면... 그건 아무짝에도 쓸모없는거죠

그래서 SpeedSeq와 기라성같은 변이 탐지 툴들과도 비교 해봤습니다.

somatic/germline 분석 툴들을 가리지 않고 모두 비교해봤습니다. GATK의 Haplotype Caller, Mutect, VarScan2와 같은... 기존에 너님들이 많이 쓰던 툴들이랑 비교해서 결과 다르지 않아. 라고 얘기하고 있습니다.

그런데 사실 저는 SpeedSeq을 사용한 이유가 속도가 빠르면서 bwa와 같은 기존 정렬 프로그램 대비 결과가 정확해서 사용한것이 아닌 그냥 LUMPY tool을 사용하기 위해서 였다는게 함정

사실 이 정렬 tool이 nature에 출판되었는지도 몰랐다는..

LUMPY사용하려고 메뉴얼보니 SpeedSeq 결과 사용하세요 라고 적혀 있어서 단지 사용 했었을뿐... 그 후에 나도 몰라 하고 있었는데...

그냥 한번 들쳐봤는데 다시 검토해볼만한 tool일거 같긴한데..

"Reference Sample 백만번 돌려서 결과 동일해요" 하는것보다 임상 샘플 10개만 분석해봐도 그 진가를 알아볼수 있으니...

만약에 제가 사용하게 된다면 다음에 다시 글하나 올려보도록 하죠 :)

출처: @ye._.vely618

역시 변이 탐지에서도 machine learning

역시 세상에는 내마을을 알고 있는 분들이 있다는..

논문 제목은 Systematic benchmark of state-of-the-art variant calling pipelines identifies major factors affecting accuracy of coding sequence variant discovery 입니다.

doi: https://doi.org/10.1186/s12864-022-08365-3

결론은 누가누가 변이를 잘 찾나 테스트 되겠습니다.

그래서 샘플 준비도 GIAB과 함께 non-GIAB 데이터도 준비하고, 정렬 프로그램도 BWA, BOWTIE, Isaac, Novoalign 다양하게, 변이 caller도 GATK, FreeBayes, Strelka이외에도 DeepVariant나 Clair3와 Octopus 등 다양한 변이 caller를 도입해서 테스트를 진행해 보았다고 합니다.

Clair3와  Octopus는 처음들어 봤네요 @.@ 역시 사람은 공부를 해야함

그리고 GIAB외에도 non-GIAB 데이터를 활용한것은 또 새로운 접근법인듯합니다. 아무래도 많은 연구가 이뤄진 데이터와 그러지 않은 데이터간의 차이가 있을 수 있고, 아직 T2T를 사용한 변이 탐지 벤치마킹 논문을 찾아보진 못했는데 이 또한 조만간 나오겠네요. 이미 나와 있을수도.. 

여튼 이것저것 따져 봤을 때 정렬 프로그램은 일단 Bowtie2는 성능이 저하되는 결과를 보여주기에 사용하면 안되는 방법이고, 변이 탐지에서는 DeepVariant가 좋은 성능을 보이는 결과를 얻을 수 있었다고 합니다.

그리고 GIAB와 non-GIAB 샘플을 비교해본 바 현재 사용하는 분석 방법이 GIAB에서만 좋은 결과를 보이고 non-GIAB에서는 그렇지 않다는 것, aka GIAB 샘플이나 non-GIAB 샘플이나 편견없이 잘 분석된니, 현재 분석 방법들을 활용해도 문제가 없다는 것을 확인하였다고 합니다.

그러나 아직 존재하는 몇 가지 문제점을 지적하기도 했습니다.

기계학습 방법을 사용하는 caller 같은 경우 모델에 따라 변이 탐지에 문제가 발생할 수 있기 때문에 조심해서 사용하여야 하고, 앞서 얘기했던 T2T 표준 유전체를 사용하였을 때 발생할 수 있는 기존 정렬 프로그램이나 변이 탐지 프로그램의 한계점이나 영향(부정적인)은 확인된바가 없기떄문에 검토가 필요하다는 점, GIAB이나 non-GIAB이던 일반적인 벤치마킹에 사용하고 있는 표준 샘플들의 사용 region에 대한 문제, 대게 잘 정의된 변이들은 유전자 영역에 분포하고 있기 때문에 비유전자 영역에 있는 변이 또는 시퀀싱이 잘 되지 않은 영역들에 대한 정보는 제한적일 수 있기에 이런 단점들이 보강된 표준 샘플들이 필요하는 점, NGS 데이터의 경우 지속적으로 개선되고 새로운 방법이나 도구들이 개발되고 있으나 민감도, 재현성과 같은 변이 탐지 성능 지표에 집중되어 있지 분석 시간이나 사용의 편의성, 프로그램 설치 난이도와 같은 비교적 중요하게 다루지 않는 항목들에 대해서도 관심이 필요하다는 것들에 대해서 언급을 해주었습니다. 

간만에 최신 변이 탐지 벤치마킹 논문을 한번 읽어봤는데, 저는 유익한 시간이었는데 어떠셨나요? 

이제 즐거운 주말을 보내러~ :)

ps. 근데 chatGPT한테 요약 해달라고 하니 왜 이 논문에서 Dama dama (사슴)을 왜 그리 찾는지... 처음에는 내가 url을 잘못 입력한줄 알았는데... 

출처: @ye._.vely618

8개의 variant caller 통합 도구

2018년 WGS이나 WES 혹은 Target Seq을 한 후 변이를 확인 할 때 으레 GATK를 사용하는 우리들에게 감사하게도 여러개(정확히는 8개)의 변이 caller 결과를 통합해서 확인 할 수 있는 논문이 발표되었습니다.

진짜 감사할지 이름만 appreci할지...

(구글 검색결과 글쎄요... 이유가 무엇인지는 모르겠지만 오늘이 2020년 9월 12일인데 인용 횟수가 4개네요..)

목적은 NGS를 임상에 사용하려면 유효한 variant를 call해야 하는데 분석 tool마다 어떤 variant는 call하고 어떤 variant는 call하지 못하는 경우가 발생해서 그럼 여기서 나온 결과와 저기서 나온 결과 합치자!!

근데 이 작업을 할 하는데?? 이게 그렇게 쉽다고?

그렇죠 이런저런 허들이 있고 동일한 위치에 A변이와 B변이가 있다고 나왔을 때 어떤 변이를 call했다고 인정할것인가?

모 변이를 call하고 변이들을 merge하고 필터링하는 파이프라인을 개발했다는 것이 이 논문의 결론이고 민감도는 0.93-1.0, PPV는 0.65-1.0사이, 8개의 도구를 combine하였는데 caller를 줄이면 appreci8의 성능은 떨어지니깐 그러지 마세요 라고 얘기하고 있습니다.

여기서 사용하는 8개 caller들은 다들 많이들 사용하고 있는 GATK, Platypus, VarScan, LoFreq, FreeBayes, SNVer, samtools, VarDict되겠습니다.

appreci8은 여기서 docker로 제공되고 있고 분석을 한 일루미나 데이터는 여기에 위치하고 있습니다.

출처: @ye._.vely618