cnvkit 설치 방법

간만에 프로그램 설치 기록 하나 남겨 봅니다.

설치할 tool은 Copy Number Variant 탐지에 대명사 중 하나인 CNVKit입니다.

참조할 사이트는 당연히 공식 cnvkit github고요 

첫번째 방법은 conda를 이용한 방법!

$ conda config --add channels defaults 
(conda를 설치해서 사용하시는 분들은 굳이 defaults는 안하셔도 됩니다.)

$ conda config --add channels conda-forge
$ conda config --add channels bioconda
$ conda install psutil
$ conda create -n cnvkit cnvkit
라고 명령어를 입력하면 엄청 많은 패키지들을 설치하겠다고 나옵니다.

$ source activate cnvkit

(cnvkit)$ python cnvkit.py -h

numpy가 없다고 나와서 다음과 같이 가상 환경 안에서 numpy 설치

(cnvkit)$ conda install numpy

그러나 conda를 이용한 방법은 제대로 작동을 안해서...

$ source deactivate

이유는 꼭 알아야 할까요? 다른 방법으로 설치하면되지요!

그래서 걍 github에서 소스 파일 다운 받아서 pip를 사용하여 설치!!

$ git clone https://github.com/etal/cnvkit

$ cd cnvkit/

$ pip install -e .

$ ~/Python-2.7.12/bin/python cnvkit.py -h

기본 pip를 사용했기 때문에 python-2.7.12에 설치가 되었고, 만약 pip3를 사용하여 설치하였다면... python3을 이용하면 되었을 것으로 예상됩니다.

그래서 오늘은 conda와 pip를 이용한 설치 방법에 대해서 알아보았습니다.

다음에 또 유익한 정보를 가지고 찾아오도록 하겠습니다.

출처: @candyz_hyojung

탐지한 varaint가 대체 왜 이러지?

이것저것 변이 call을 하다보면 가끔씩 여러개의 변이가 한번에 call되는 경우가 있습니다.

여러개의 변이가 한번에 call되는 경우는 대게 multi allelic 이거나 multi-nucleotide variant 정도일겁니다.

※ Multi Allelic

1번 염기서열 위치에 Reference는 TA였는데 변이 call결과에 T,TAA,TAAA 가 확인되었을 때 를 얘기하는 경우

※ Multi Nucleotide Variant

159030번 염기서열 위치에 Reference가 TAACCTTTC였는데, TGACCTTTT로 call되었다고 하는 경우, 일반적으로 이런 경우 159031번과 159038번만 reference와 다른데 왜 뭉뚱그려서 여기가 다 변이입니다 하는 경우 입니다.

TAACCTTTC

TGACCTTTT

그러나 다행히 우리에게는 VT라는 천하무적 tool이 있습니다.

이런 multi allelic나 multi nucleotide variant 가 있는 경우 이것을 뜯어서 분리하는 sub command를 가지고 있다고 하네요 :)

난 multi Allelic를 분리하고 싶어요! 라면 

vt decompose input.vcf -o decomposed.vcf 

이렇게

아니에요 나는 multi nucleotide variant를 분리하고 싶어요! 라면

$vt decompose_blocksub -p input.vcf -o decomposed.vcf 

이렇게 명령어를 실행시켜 주면 된다고 합니다.

multi allelic가 나오고 multi nucleotide variant가 당신을 괴롭히더라도 당신 곁에는 vt가 있다는 것을 잊지 마세요.

다시 또 유익한 정보를 가지고 돌아오도록 하겠습니다. :)

출처: @ye._.vely618

무균체액에는 얼마나 다양한 박테리아가 있을까? 그 10년의 기록

10년에 걸쳐 뇌척수액, 심낭액, 복막 및 흉막액 같은 체액(NSBF)에 어떤 박테리아들이 서식하는지 확인한 논문이 있어 한번 가져와봤습니다. 

제목은 Comparison of 16S Ribosomal RNA Targeted Sequencing and Culture for Bacterial Identification in Normally Sterile Body Fluid Samples: Report of a 10-Year Clinical Laboratory Review 이고, doi는 10.3343/alm.2020.40.1.63 입니다.

테스트한 샘플은 312개의 NSBF이고, 16S rRNA 분석과 배양 실험을 동시에 진행하여 비교해보았다고 합니다.

metagenome을 사용하는 이유가 시간도 오래 걸리고 번거로운 배양실험을 대체하기 위한 목적이 크다보니 비교실험을 통해 사용에 당위성을 확보하기도 합니다.

여튼 10년동안 모든 음성 샘플 277개와 양성 샘플 35개 중 277개의 음성 샘플을 정확히 구분해 냈으나 35개 샘플중 시퀀싱과 배양 방법을 통해서 확인된 양성 샘플은 10개 였습니다.

전체 312개 중 92%의 정확도? 라고 할 수 있으나, 이 10개 샘플은 16S rRNA와 배양 방법으로 모두 양성이라고 확인한 결과이고, 16S rRNA 방법으로, 배양 방법으로 확인한 결과는 35개 모두 다 잘 진단 하였습니다. 

그래서 논문에서도 기존의 배양방법으로만 하는 것보다 16S rRNA 시퀀싱 방법을 배양 방법과 함께 사용하면 체액 샘플에서 박테리아를 더 정확하게 식별할 수 있고, 항상제를 이미 처방받은 환자나 혐기성 감염이 의심되는 경우 배양 방법만으로는 한계가 존재하기 때문에 함께 사용하는것이 좋은것 같다는 의견이었습니다.

개인적으로는 16S rRNA 단독으로 사용하였을 때 앞도적인 차이로 더 잘 진단 할 줄 알았는데 꼭 제 마음같지는 않은듯 합니다. :)

음... 근데 안타깝게도 시퀀싱 데이터가 공개되어 있지 않은듯 한데.. 좀 더 자세히 뜯어보도록 하겠습니다. SRA 번호를 찾게되면 한번 분석 해보는 것으로 :)

그럼 다음에 또 흥미로운 논문으로 찾아뵙도록 하겠습니다.

출처: @ye._.vely618

누가누가 미생물 프로파일링을 잘할까?

NGS가 태동된지 20여년.... (너무 과했나?) 대중적으로 관심을 받아 쓰는지는 10여년이 훌쩍 지나가고 있는 시점에 예전에는 454나 Solexa 정도 만져보던 시절에서 지금은 다양한 시퀀서들이 나와서 연구자들의 다양한 궁금증을 일선에서 해결해 주고있습죠 :)

여튼 그래서 21년 기준에 보편적으로 또는 미래에 대세가될 시퀀서들을 대상으로
누구나 관심있어하는 장내 미생물 프로파일링을 어느어느 시퀀싱 플랫폼이 잘하나 비교해보는 논문이 있어서 가져와봤습니다.

제목은 Comparison of 16S rRNA Gene Based Microbial Profiling Using Five Next-Generation Sequencers and Various Primers 이고,

doi: 10.3389/fmicb.2021.715500 입니다.

(물론 저자중에 제가 아는 분이 있어서 그런것은 아니고요, 구글링 하다가 찾아진겁니다.)

그래서 비교해볼 시퀀서는

MiSeq, IonTorrent, MGIseq-2000, Sequel II 그리고 MinION 까지.. ..
짧은 read와 긴 read들을 생산하는 대표 시퀀서들을 5개를 가지고 테스트를 해봤습니다.

시퀀싱을 잘 했는지 못했는지 확인하려면 시료의 정답을 미리 알고 있어야 겠죠?

그래서 한국 식약처에 등재된 19종의 미생물 종중에 8종을 선별하여서 다양한 비율의 Mock community를 만들어서 테스트 했다고 합니다. 

그런데 Mock community내에 미생물들의 비율은 어떻게 확인했냐!!
digital PCR을 사용해서 Mock community내 미생물들을 정량해서 확인했다고 합니다. 물론 Sequins (스팽글?, aka Sequencing spike-ins)이라는 방법을 활용할 수 있다고 하는데 다양한 박테리아에 대해서 모두 Sequins를 만들기 어렵기 때문에.. 이방법을 사용했다고 합니다. 사실어떤 방법이 golden standard인지는 모르겠으나 연구 디자인에 적합하면 되지 않을까 합니다.

여튼 8개 Mock community를 제작하였고, 각각에 시료를 바탕으로 5개의 시퀀서로 시퀀싱을 진행하였습니다. 그리고 분석은 MOTHUR을 사용해서 진행하였다고 합니다.

그럼 결론은 몬데?
뭣이 중헌디?

음... 개인적으로는 16S rRNA 서열을 한번에 확인 할 수 있는 롱리드 플랫폼이 숏리드 플랫폼보다 편향이 적다라는 결과를 기대했으나.. 도리어 숏리드 플랫폼에 비해서 롱리드가 더 편향적(과대 또는 과소 표현)이었다는... 물론 이게 긴 길이의 리드를 시퀀싱하기 위해서 전처리로 PCR단계에서 비롯된거 같다는 의견이었습니다만, Sequel II같은 경우 숏리드 플랫폼과 유사한 양의 결과물을 확인하기 위해서는 더 많은 비용이 소요될텐데... 그럼 롱리드 플랫폼을 사용할 이유가 딱히 없다는게 문제가 될듯합니다.

Figure 3,4,5를 잘 뜯어보면 

Bifidobacterium breve의 경우 숏리드 플랫폼에서 상대적으로 과소 표현되고,
Limosilactobacillus fermentum의 경우 롱리드 플랫폼에서 과소표현되고, 반대로 Lactococcus lactis subsp. lactis의 경우 롱리드에서 과대표현 되고,
Lactobacillus acidophilus의 경우는 플랫폼 상관없이 과소표현 되기도하고..

함께 있는 종에 따라 영향을 받기도, 받지 않기도 하기 때문에 해석을 할 때 고려해야할게 한두가지가 아니라서 좀 어렵죠. ㅎㅎ 

그리고 숏리드의 경우 가장 큰 문제점이 한정된 영역(V3-V4)의 서열만 가지고 확인하다보니 서로 다른 균주로 분류되는 문제가 있었고 이는 보통 probiotic bacteria인 Lactobacillus casei group(LCG)에서 확인되어서 LCG, probiotic bacteria 분석에는 V3-V4는 좀 피해야할듯 합니다.

결론은 연구에 맞게 적절하게 잘 사용하고, 직접 실험하지 않는 저같은 게으름뱅이들에게는 이리저리 분석할때 표준 데이터로 사용할만한 좋은 데이터가 확보되었다는 것입니다. :)

출처: @ye._.vely618

NCBI에서 제공하는 ribosomal RNA Database

때는 바야흐로 2020년 초

NCBI에 Blog에 새로운 ribosomal RNA 데이터베이스가 출시되었다는 글이 하나 떴었네요...

사실 그 전부터 BLAST용 ribosomal RNA 서열은 제공하고 있었습니다.

다만 그 전까지는 NCBI에 수집된 nucleotide 서열을 모아놓은 수준이었던것 같은데,

2020년에 공개된 데이터는 단순히 모아놓는 부정확한 정보 수준이 아닌 각 서열을 정확하게 식별하고 분류할 수 있도록 엄선하였다고 하네요 

rRNA뿐만 아니라 ITS 서열까지.. 2020년즈음에는 microbiome에 이어 mycobiota도 관심이 증가하고 있었던 시기였던터라 이전에 ITS 서열을 제공하지 않았던것 같은데, 역시 NCBI 훃님들은 페달 밟으면 아주 시원하게 뽑아주는듯 합니다.

여튼 요즘에는 16S, 18S, ITS 서열들을 잘 정리해서 식별할 수 있도록 (aka taxonomy 정보가 잘 정리되어 있다는 것이겠죠) 제공하고 있습니다.

>여기< 에 우리가 알고 있는 nt db와 nr db 말고도 다양한 local용 blast database들이 제공되고 있으니 잘 다운로드 받아 잘 사용하면 좋을 것 같습니다. 

또 유익한 정보를 가지고 블로그에 글을 적어보도록 하겠습니다. 

출처: @ye._.vely618