어떤 시퀀서가 NIPT를 잘 할까

간만에 NIPT 논문을 들고 와봤습니다.

어떤 시퀀서가 NIPT에 더 적합한가 알아보자 되겠습니다.

2019년에 출판된 논문으로 "Prospective head-to-head comparison of accuracy of two sequencing platforms for screening for fetal aneuploidy by cell-free DNA: the PEGASUS study" 이고, 

doi는 https://doi.org/10.1038/s41431-019-0443-0 입니다.

위에서 언급했다 싶이 시퀀싱 기기별 NIPT의 임상적 성능을 비교한 내용으로 T13/18/21 그리고 Monosomy X 검사에 대해서 테스트를 진행했다고 합니다.

그리고 비교한 시퀀싱 기기는 시퀀싱 시장의 대장인 illumina의 HiSeq와 Thermo의 Proton이라고 하네요.

결과적으로는 둘다 정확도는 99%이상이었으나 미세하게 차이가 결과에 차이가 있었다고합니다. 

민감도와 위양성률 모두 HiSeq 성능이 우수했고, 시퀀싱 처리시간에서는 Proton이 짧은 처리 시간을 자랑한다고 합니다.

표면적으로 보면 일루미나의 HiSeq이 Thermo의 Proton보다 우수하다고 결정 내릴 수 있으나 사실 꼭 그렇지는 않을듯합니다. 실험 디자인에서 서술되어 있는 내용을 보면 cell-free DNA 추출 후 두개로 나누어 각각 기기에서 실험을 한건 같아 보이지 않아서 입니다. 

혈액 채취 후 각각의 실험실에 보내어 각 실험실에서 자체 프로토콜로 진행하지 않았나 싶습니다. 그래서 정확하게는 실험실간의 성능 비교이지 않나 싶습니다.

NIPT에서는 cell-free DNA내 태아의 cell-free DNA 양이 굉장히 중요하기 때문에 실험을 하는 사람의 숙련도나 방법에 따라 분석을 할 수 없기도 해서..

여튼 그래도 중국에서 진행했던 (대략 1만여건 정도..) 대규모 연구 이후로 꽤 큰 샘플 개수이고 보통 단일 플랫폼으로 테스트를 진행하는데 서로 다른 기술 기반의 플랫폼(광학과 수소이온)에서 테스트를 하여 플랫폼 간 우위에 대한 내용은 얘기하기 어렵지만, 어찌 됐던 cell-free DNA 기반의 선별 검사는 효과적인 방법이라는 것을 다시 한번 확인하는 연구이지 않았나 싶네요

결론은 illumina던 Thermo던 압도적 우위에 있는 플랫폼은 없으니 각자 application과 상황에 맞는 플랫폼과 방법을 선택해서 하는 것이 중요하다. 정도? 이지 않나 싶네요 :)

아.. 연구 이름인 PEGASUS는 "PErsonalized Genomics for prenatal Aneuploidy Screening USing maternal blood"의 약자라고 합니다. PEGASUS 홈페이지도 있습니다.

출처: @ye._.vely618

NIPT는 왜 false negative에서 자유로울 수 없는가

NIPT는 데니스 로훃아께서 산모 혈액속에서 태아의 cell free DNA가 소량 존재하고, 탐지할 수 있는 것을 알게 된후 시퀀싱을 사용하여 태아의 DNA를 탐지하는 기술을 개발하면서부터 사용되었다. (그와 함께 온갖 특허로 돈방석에 올랐는지는 모르겠지만 일단 특허는 가지고 있으시다능 ㅜㅅㅜ, 관련기사는 >여기< 일루미나,Lo,시쿼놈 이 IP pool을 만들어서 세계여행중)

여튼 NIPT대한 서술은 이쯤하고..

NIPT가 침습적검사를 대체할 수 있었던 큰 이유는 바로 비침습이라는..

침습의 경우 높은 확률(몇인지 가물가물..)로 유산 가능성이 있으나 정확한 진단을 내릴 수 있기 때문에 꼭 필요한 산모들에게만 하는게 좋은데... 그 꼭 필요한 산모들을 어떻게 선정하느냐가....

그래서 NIPT로 스크리닝하고 고위험군의 산모들에게서 스크리닝결과 부정적인 의견이 나오면 침습검사를 권장하는것으로 이제 체계가 잡혀가는데..

이 NIPT가 갱장히 혁신적인 기술임인 반면에 치명적인 단점이 있었는데 위음성의 문제가 좀 있다

근데 산모 혈액속에 떠돌아 다니는 태아의 DNA(그냥 DNA는 아니고 cell-free된 fetal DNA)를 탐지해서 스크리닝하는건데 왜 위음성이 나타나는걸까?

엄밀히 말하면 산모 혈액속에 있는 태아의 DNA는 아니고 태아의 DNA와 시작을 함께하는 조직의 DNA(chorionic villi라는 한국말로 하자면 융모막융모에서 유래된 DNA)라서 위음성이 나타난다는...

from zygote to blastocyst

False Negative NIPT Results: Risk Figures for Chromosomes 13, 18 and 21 Based on Chorionic Villi Results in 5967 Cases and Literature Review

바로 이 논문이 NIPT에서 위음성이 왜 나타나는지 얼마나 나타나는지 알아보는 논문 되겠습니다.

NIPT에서 사용되는 태아의 cell free DNA의 기원에 대해서 이해를 해야지 NIPT의 위음성과 위양성에 대해서 이해 할 수 있습니다.

위의 그림과 이유를 표로 정리하면 다음과 같다.

자세한 NIPT의 정확도 수치같은 내용은 논문을 탐독하면 알 수 있을 것이고

오늘의 논문에서 NIPT의 위음성의 이유와 왜 그러는지에 대해서 알면 충분히 보람찬 하루가 되지 않을까합니다. 

출처: @ye._.vely618

엄마한테서 니가 왜 나와

중국에서 비 침습성 산전 검사(NIPT)를 활용해서 흥미진진한 연구를 진행해서 2018년도에 투고한 논문을 한번 훑어봤습니다.

Genomic Analyses from Non-invasive Prenatal Testing Reveal Genetic Associations, Patterns of Viral Infections, and Chinese Population History
>논문은 여기로<


NGS시대에 유전학연구를 할 때 가장 문제되는게 표본 크기가 제일 문제되고 있죠, 시퀀싱을 하자니 기본적인 depth가 필요한데 적절한 depth로 하자니 비용때문에 표본 크기를 줄여야 되고.. 표본 크기를 줄이자니 그정도 시퀀싱해서 얻어진 결과가 잘 될까?

그래서 중국 연구진(물론 미국과 덴마크 연구진도 합세했습니다.)이 NIPT 데이터를 이용해서 유전체 연구를 진행해 보았답니다.

NIPT는 shallow sequencing의 대명사죠, 그럼에도 불구하고 전세계적으로 스크리닝방법으로 정착을해서 현재도 굳이 침습적 산전진단을 받지 않아도 되는 산모들에게 대안이 되어 주고 있습니다.
(오늘은 NIPT 성능과 위음성과 같은 것은 논외로 하겠습니다.)

산모들의 NIPT 데이터를 사용해서 유전학 연구를?
이게 될까? 저도 될줄은 몰랐는데 이분들 일단 했으니 논문이 나왔겠죠..

대한민국에도 엄청 많은 NIPT 데이터가 쌓여 있을텐데.. 한번 해봐도 나쁘지않을 것 같습니다. (물론 동의서가... ㄷㄷㄷ )

결론적으로 슬쩍 읽는 NIPT 가지고 거기다가 두명혹은 그 이상의 정보가 섞여 있는데 그거가지고 모 뭐할꺼야? 라고 하신다면 큰 오산!
슬쩍 읽는가지고도 집단유전학, Association mapping study 그리고 (아놔 이거 모야?인데 진짜 나온다는.. ㅋㅋ ) 인간 혈장내 바이러스 연구를 할 수 있다고 합니다.

일단 NIPT로 얻어진 allele 정보가.. 진짜 쓸만한가 알아보았슴다.
NIPT 데이터(CMDB)에서 call된 SNP들이 기존의 1KG CHN,EAS 및 전체에서 얼마나 확인되었는지, CMDB에서 novel variant들이 있는지 확인했고
non-reference allele freq를 가지고 1K genome의 CHN allele과 CMDB의 allele를 비교해보았습니다.

물론 Novel은 적게, gnomAD, 1KG 데이터와 많이 공유하고, 상관관계는 높습니다.


변이에 대한 결과를 확인 했으니 이제 중국의 유전학 썰을 한번 풀어보는걸로..
분석에 걸림돌이 되는 오류같은것들은 적절히 제외해주고 한족에 대해서 한번 확인해봤습니다.

31개 행정구역의 4만5천명 한족이라고 확인된 샘플들을 PCA분석을 해보 았는데 위도에 따라 차이가 많이 보였습니다(이 결과는 이전 연구 결과와 동일한.., 동서에 의한 차이는 별로.. ,논문내에서는 이주정책에 의해 설명되는것 같다고 하는데 정확히 무슨 말인지는.. 1996년 논문을 봐야할듯 하네요. ). 그러나 그 외 소수민족에서는 걍 경도, 위도 상관없이 다 차이가 있었다고 하네요. 그래야 소수민족이지 않을까하는 생각이기도 합니다.
가장 차이가 나는 집단은 신장지방의 Kazakh, Uyghur, 내몽골 지역의 Mongol이었습니다.
(일단 언어가 다르다고 하네요)

그리고 키와 BMI와 같은 Multiple Complex Traits의 Phenotype - Genotype Association을 확인해봤슴다.
지금까지 연구된것들과 비슷한 SNP들이 확인되었고 CBK, GIANT, UK BioBank 대규모 set들과 비교해봤을 때도 크게 다른 값을 보이지 않았습니다. 그리고 NIPT라는 특별한 샘플이라는 점을 고안하여 쌍태아와 관련된것도 한번 확인해 보았답니다.
(산모 연령에 대한 것도 확인했다고 했는데... 이건 유전적이라기 보다는... 사회학적인 부분이지 않을까했는데.. 모 연관성이 높은 SNP를 찾긴 찾았는데 저는 패스 하도록 하겠습니다.)
중국의 NIPT 샘플중 470여명의 쌍둥이들이 있었는데(초음파로 확인) NRG1의 rs12056727d이 꽤나 흥미로운 좌위로 확인되었습니다. 이 SNP는 UK BioBank에서 갑상선 항진증과 관련이 있는것으로 확인되었습니다. 그리고 갑산성 기능은 불임과 관련이 있습니다. NRG1유전자에 대한 내용은 일단 넘어가더라도 쌍둥이를 임신한 산모는 갑상선 자극 호르몬 수준이 낮아지는 경향이 있습니다.


그리고 오늘 포스팅 제목에 부합하는 내용인, 산모 혈장에서 보이는 circulating viral DNA!
왜왜왜 나오냐고

일단 NIPT에서 수행된 시퀀싱 결과에서 human에 mapping되지 않는 read들을 따로 모아서 NCBI 바이러스 DB에 확인해봤고 그 결과를 Figure5의 A,B에 정리했습니다. 그렇지만 우리가 잘못 분류하거나 샘플이 오염 되었을 수도 있기에 검토하였다. 대부분은 특정 지역에 국한되었고, 이미 인체내 genome에 내재화 되어 있는 HCV서열이 있는것을 확인했지만... 그 대상 숫자가.. 고작 3명..

근데 중국에서만 그런건 아니고 유럽쪽 연구에서도 바이러스가 나왔었다능
-물론 바이러스 종류가 좀 다른 것으로보입니다.
실험 디자인이 달라서 그런것인지 진짜 지리적으로 차이가 있는것인지 모 좀더 확인해봐야 하겠지만... 크.. 인구도 많고 땅덩어리도 작지 않은 중국 아니겠습니까.
HBV관련해서 민감도도 계산했고 지리적 분포를 확인해서 지리적으로 확인되는 바이러스 종류들이 다르다는 것을 확인했습니다.

그래서 NIPT 데이터를 잘 활용한다면 공중보건에도 꽤나 유용할것 같다는게
저자들의 논지였고 현재 NIPT 서비스를 하고 있는(그러나... 내년에도 하고 있을거라는 보장은... 어느 이유로든지 밝지 않은) 본인에게도 걍 헛소리로 보이지는 않고 진짜 유용할것같다능...

ps. 근데 일주일에 논문하나 읽기가 이렇게 어려웠나;;;

출처: @sana_twice.09

산모의 건강상태가 NIPS에 미치는 영향

Noninvasive prenatal testing for aneuploidy using cell-free DNA – New implications for maternal health

간만에 하는 업무와 갱장히 밀접한 글 하나 투척이라기 보다는
간단히 정리 정도...


NIPS/NIPT, 비침습적 산전 스크리닝 혹은 테스트의 약자로 산모의 혈액내에 있는 태아의 cfDNA를 사용하여 태아에 문제가 있는지 확인 할 수 있는 기술로써 홍콩대학의 Denis Lo 옹께서 산모 혈액내에 태아것도 있다. 그리고 산모와 태아의 것을 구분 할 수 있다고 밝혀주셔서 전세계적으로 빠르게 확산되었죠.


지속적인 연구를 통해 Trisomy 13/18/21에 대해서 우수한 정확도를 보여주고 있습니다만, NIPS/NIPT를 하다보면 이게 검사가 잘 안되는 경우가 있습니다.

그러나 어떠한 이유인지 분석 할 수 없는 경우나 알 수없가 없었습니다.
그래서 지속적으로 축적된 임상 경험을 바탕으로 NIPS/NIPT와 산모의 건강과 관련하여 상호관계가 있을것으로 추측하였고 그래서 한번 어떤 것들이 NIPS/NIPT의 성능에 영향을 미치는지 조사해본 논문하나를 살펴보았습니다. :)


산모의 비만 (Obesity)

NIPS/NIPT를 할 때 의뢰서에 키와 몸무게 란이 있습니다. 이는 BMI이 치수로 산모의 체질량을 확인하는데 BMI가 높을수록 NIPS/NIPT에 필요한 태아의 cfDNA의 비율이 떨어지기 떄문에 NIPS/NIPT가 실패할 확률이 높아진다고 보고되고 있습니다.
지방세포에서 세포 사멸과 괴사로 혈중 내 태아의 cfDNA보다 산모의 cfDNA 양이 상승하여 태아의 cfDNA 비율을 떨어트린다는 것입니다.


자가면역질환 (Autoimmune disease)

자가면역질환은 문자 그대로 자기 자신을 공격하는 질환으로 세포 주기가 굉장히 짧아지는것이 문제가 되어 임신하지 않은 전신성 홍반성 루프스(SLE) 환자에서 혈중 cfDNA가 증가하는 것을 확인했습니다. 그래서 SLE가 있는 임산부의 NIPS/NIPT결과를 해석할 때는 주의를 기울여야 한다고 말하기도 하였습니다.


태아 분획에 영향을 줄 수 있는 것들 (Other maternal influences on fetal fraction)

표2(논문 참조)에 나와있듯이 태아 분획과 다양한 산모의 특징(인종, 흡연여부, 고혈압, 나이등등등)들은 통계적으로 유의한 연관성을 가지고 있으나 이러한 산모의 특징들은 상반된 결과를 나타내는 결과들도 있기 때문에 덜 중요해 보인다고 합니다.
(인종 ㅂㄷㅂㄷ, ㅂㄷㅂㄷ 했다고 인종차별자는 아니니 오해 없으시기 바랍니다.)


산모가 받은 처방 (Maternal medications)

산모가 복용하는 약 또한 NIPS/NIPT의 결과를 방해 할 수 있습니다.
LMWH(Low molecular weight heparin)은 NIPS/NIPT에 부정적인 영향을 미치는 첫 물질이었습니다. heparin과 NIPS/NIPT의 부정적인 결과에 대해서 정확한 메카니즘은 알려져 있지 않지만 NIPS/NIPT 검사를 위해서는 heparin 복용을 일정 시간 중단해야 합니다. 그리고 IVIG(Intravenous immunoglobulin)의 경우 cfDNA가 증가하는 것처럼 보고 되었지만 NIPT의 분석 성능에는 확인되지 않았습니다.


장기 이식 받은 산모 (Organ transplant recipients)

장기 이식을 받은 산모의들의 NIPS/NIPT는 고려를 해봐야 합니다. 특히나 장기 이식받은 장기가 남성 기증자라면 특히나 주의해야한다. 남성 기증자의 장기는 Y염색체 특이적 cfDNA서열을 만들어내어 잘못된 판단을 유발 할 수도 있다. 그리고 NIPS/NIPT는 염색체 이상이 있는 산모가 하면 정확하지않은 결과를 받아볼 수 있기 때문에 NIPS/NIPT 전 상담을 꼭 진행해야 합니다.


※ 정정 :하단은 NIPS/NIPT를 해서 산모로부터 우연히 알게되는 것에대한 내용입니다.

산모의 성염색체 상태 (Maternal sex chromosome conditions)

NIPS/NIPT에서 X염색체의 정확도는 13/18/21과 같은 상염색체보다 본질적으로 좋지 않습니다. 다른 이수성에 비해 X 염색체 이상에 대해 더 높은 태아 및 태반 모자이크 현상이 있습니다. 산모에 따라 나이와 연관있는 X 염색체 손실이 일어나기도 하고 일부 산모에게서는 정상 XX에서 저수준으로 XO/XX 모자이크로 바뀌기도 합니다.또한 많은 SCA(Sex chromosome aneuploidies)는 불확실한 NIPS/NIPT결과를 초래하기도 합니다. NIPS/NIPT에 의해 의심된 181개 SCA case중 16 case (8.5%)가 산모에 의해 기인한 것으로 확인되었다고 합니다.


산모의 상염색체 이상 (Maternal autosomal abnormalities)

산모의 상염색체이상도 잘못된 NIPS/NIPT 결과를 발생시킵니다. 이런 경우 산모가 저수준의 모자이크 T18이나 염색체 13 혹은 18번에 부분적으로 중복이 있어 발생할 수 있습니다. 최근 NIPS/NIPT 분석 중에 22q11.2와 같은 미세결실 증후군을 탐지하고 있는데 한 연구에서 고위험의 미세 결실 결과 중 60%(20 case/32 case)가 산모에 의한 것이지 않을까 의심되고 있습니다. 그러나 다른 NIPS/NIPT 제공 업체의 경우 고위험 미세 결실 결과중 2%만이 산모에 의한 것으로 확인(?이 진짜 된건지 산모를 검사를 했는지는 까지는)됐다고 합니다. 그런데 이런 차이가 나는 이유는 NIPS/NIPT분석 방법이나 reference의 편향성이나 인구 특징들에 따라 달라지기 때문에 분석 결과에 대한 비교까지는 어려운것 같다고 합니다.


산모의 종양 (Maternal malignancy)

종양세포는 NIPS/NIPT 분석에 사용하는 혈장내의 cfDNA를 기여하고 있다는 것에 누구도 부정은 못할 것 입니다. 종양이 NIPS/NIPT 결과에 영향을 준다는 사례 보고는 여기에서 설명되었습니다. 125,426명의 산모 집단에서 산모의 종양으로 인해 NIPS/NIPT결과가 불일치한 산모 10명에 대해서 정보를 공개했습니다. 산모들의 종양/암 유형은 lymphoma, leukaemia, colorectal and anal cancers 이었다고 합니다.
그리고 산모들은 추가적인 생물정보학적 분석으로 비특이적인 CNV들을 보여줬는데 NIPS/NIPT에서 관찰된 비특이적인 패턴들은 종양/암 치료후 사라져서 종양/암과 NIPS/NIPT와의 관계를 확인 할 수 있었습니다.


그래서 종합적으로 요약하자면 임상적으로 NIPS/NIPT에 대한 경험과 자료가 증가함에 따라 산모의 건강과 밀접한 관련이 있다는 것을 확인 할 수 있었고 비만, 면역질환 및 LMWH 치료와 같은 NIPS/NIPT 결과에 영향을 줄 수 있는 산모의 상태에 대해서 인지하고 있어야합니다(안그러면 위양성 결과를 받아들고 옳지못한...).
NIPS/NIPT결과로 얻어진 2차 산모의 위험 소견에 대해 산모에게 알리는 것도 중요한 윤리적 고려사항이라고 생각됩니다.


이렇다고합니다.

간만에 업무와 관련되 내용 포스트 좀 해봤습니다.

출처: sana_twice.09