NCBI에서 제공하는 ribosomal RNA Database

때는 바야흐로 2020년 초

NCBI에 Blog에 새로운 ribosomal RNA 데이터베이스가 출시되었다는 글이 하나 떴었네요...

사실 그 전부터 BLAST용 ribosomal RNA 서열은 제공하고 있었습니다.

다만 그 전까지는 NCBI에 수집된 nucleotide 서열을 모아놓은 수준이었던것 같은데,

2020년에 공개된 데이터는 단순히 모아놓는 부정확한 정보 수준이 아닌 각 서열을 정확하게 식별하고 분류할 수 있도록 엄선하였다고 하네요 

rRNA뿐만 아니라 ITS 서열까지.. 2020년즈음에는 microbiome에 이어 mycobiota도 관심이 증가하고 있었던 시기였던터라 이전에 ITS 서열을 제공하지 않았던것 같은데, 역시 NCBI 훃님들은 페달 밟으면 아주 시원하게 뽑아주는듯 합니다.

여튼 요즘에는 16S, 18S, ITS 서열들을 잘 정리해서 식별할 수 있도록 (aka taxonomy 정보가 잘 정리되어 있다는 것이겠죠) 제공하고 있습니다.

>여기< 에 우리가 알고 있는 nt db와 nr db 말고도 다양한 local용 blast database들이 제공되고 있으니 잘 다운로드 받아 잘 사용하면 좋을 것 같습니다. 

또 유익한 정보를 가지고 블로그에 글을 적어보도록 하겠습니다. 

출처: @ye._.vely618

SAM-TB, 주인공은 나야나

결핵은 참 끊임없이 인류를 괴롭혀오는 감염병균 하나입니다.
더구나 이 녀석이 악랄한 이유는 누구에게나 동일하게 감염되는것이 아닌 개발도상국이나 저소득구간에 있는 생활환경이 그리 좋지 않은 나라나 가정에 더 잘 발병한다는 것입니다.

선진국, 다른 말로 고소득국가나 생활환경이 더 나은 곳에서 사는 사람들에게는 감염되지는 않지만 그래도 전세계가 관심있게 모니터링하고 있는 감염균중 하나일겁니다.

그래서인지 분석 Tool들이 생각보다 많이 나와있습니다.

물론 대부분 파편화되어 있었으나 최근들어 포괄적인 분석 tool들이 등장하고 있습니다.

오늘 소개하는 tool도, 이거 하나만 있어봐!!

다 할 수 있어 되겠습니다.

SAM-TB: a whole genome sequencing data analysis website for detection of Mycobacterium tuberculosis drug resistance and transmission

doi: 10.1093/bib/bbac030

이 분석 tool은 결핵균의 WGS한 데이터를 분석하는 tool이고, 약물 내성과 spoligotyping 및 NTM이라면 어떤 NTM 종인지도 구분할 수 있다. 즉 SAM-TB 하나면 결핵에 관련된 모든것을 다 확인 할 수 있습니다. 되겠습니다.

기존에 나왔었던 다양한 MTB 분석 tool들(KvarQ, PhyResSE, TGS-TB, CASTB, Mykrobe, TBProfiler, MTBseq 및 ReSeqTB-UVP)을 언급하면서 우리는 지금까지 나왔던 모든 분석 프로그램의 기능을 구현하고 있다라고 자랑하고 있고, 그런 tool을 웹에서 분석 해보실 수 있습니다. 라고 자랑하고 있습니다.

어디서? 바로 >여기<에서!!

근데 안타깝게도 오늘 (2023년 8월 29일 기준) 접속이 안되더라구요.

내일은 되길 바라겠습니다.

일단 다시 한번 중요 포인트를 짚어보자면,

MTB WGS 데이터를 사용하여
 약물 내성 변이 확인, 
 spoligotyping 확인,
 MTBC 및 NTM 확인
을 웹상에 업로드하여 분석 할 수 있다 되겠습니다만 가장 중요한 분석 사이트가 접속이 안되네요

여튼 기존에 1%씩 부족했던 기능을 가지고 있던 tool을 한 자리에 모아놨다가 가장 큰 의의일것 같습니다. 

생각보다 특이할만한 tool은 사용하지 않았고, 일반적인 NGS 분석을 해보셨다면 다뤄봤을 그런 tool들로 잘 구현했습니다.

BWA-MEM, samtools, VarScan, Kraken2와 각종 in-house script들...

사실 중요한게 약물 내성 변이의 db와 lineage, MTBC 및 NTM을 확인 할 수 있는 정보에 대한 내용이 더 잘 설명되어 있으면 좋았을텐데 그 내용은 살짝 빠져있는게 아쉬웠네요 

작년 초에 출판되었는데 벌써 웹사이트가 막히다니.. 

살짝 아쉬움을 남기고 오늘 글은 마무리하도록 하겠습니다. 

@ye._.vely618

SpeedSeq은 어디에 쓰는거지?

오늘은 연식은 좀 되었으나 빠른 분석 tool하나 가져와봤습니다.


SpeedSeq: ultra-fast personal genome analysis and interpretation

doi : 10.1038/nmeth.3505

이름하여 SpeedSeq!! 그래서 제목에 ultra-fast, 초고속이 들어갑니다.
근데... 분석시간이 얼마나 걸렸었는지는.. 기억이 잘..

논문에서는 저렴한 서버에서 50x WGS데이터를 13시간만에 align을 했다고하는데...
(저렴한서버의 정의는 CPU 16core에 128GB RAM이 장착된 서버라고 하네요)

여튼 논문에서는 50x WGS 데이터를 저렴한 서버를 사용해서 분석을 진행할 때 정렬 작업을 시간단위에서 끝냈다.. 라는 소식을 솔직히 DRAGEN 제외하고서는 들어본적이 없어서 조금 갸우뚱 하긴 합니다.

여하튼 논문에서 13시간만에 정렬을 끝냈다고 했다니!! 그렇다고 믿는게 인지상정 아니겠습니까?

근데 정렬 속도가 빠른건 큰 장점이지만 단순히 속도만 빠르면... 그건 아무짝에도 쓸모없는거죠

그래서 SpeedSeq와 기라성같은 변이 탐지 툴들과도 비교 해봤습니다.

somatic/germline 분석 툴들을 가리지 않고 모두 비교해봤습니다. GATK의 Haplotype Caller, Mutect, VarScan2와 같은... 기존에 너님들이 많이 쓰던 툴들이랑 비교해서 결과 다르지 않아. 라고 얘기하고 있습니다.

그런데 사실 저는 SpeedSeq을 사용한 이유가 속도가 빠르면서 bwa와 같은 기존 정렬 프로그램 대비 결과가 정확해서 사용한것이 아닌 그냥 LUMPY tool을 사용하기 위해서 였다는게 함정

사실 이 정렬 tool이 nature에 출판되었는지도 몰랐다는..

LUMPY사용하려고 메뉴얼보니 SpeedSeq 결과 사용하세요 라고 적혀 있어서 단지 사용 했었을뿐... 그 후에 나도 몰라 하고 있었는데...

그냥 한번 들쳐봤는데 다시 검토해볼만한 tool일거 같긴한데..

"Reference Sample 백만번 돌려서 결과 동일해요" 하는것보다 임상 샘플 10개만 분석해봐도 그 진가를 알아볼수 있으니...

만약에 제가 사용하게 된다면 다음에 다시 글하나 올려보도록 하죠 :)

출처: @ye._.vely618

누가 누가 Annotation을 잘 하나

작년에 나온 논문으로 NGS를 활용한 임상 유전체 판독 할 때 어떤 annotation tool을 쓰면 좋을지에 대한 내용입니다.

A performance evaluation study: Variant annotation tools - the enigma of clinical next generation sequencing (NGS) based genetic testing

doi: 10.1016/j.jpi.2022.100130

현재 다양한 annotation tool이 사용되고 있긴 하나 그 중에서 Alamut, ANNOVAR, VEP 3개 tool을 벤치마킹 해봤다고 합니다.

VEP는 Ensembl Variant Effect Predictor이고,
Alamut는 SOPHiA GENETICS에서 제공하고 있는 tool,
ANNOVAR은 qiagen에서 제공하고 있는 tool로 3개 tool 모두 annotation해봤다고 해봤으면 한번쯤 구경은 해봤을 tool 일겁니다.

결과를 얘기하자면 이 3개 tool을 이전에 확인되었던 298개 변이를 대상으로 벤치마킹하였고 이 중에서 VEP가 가장 성능이 좋았고, ANNOVAR이 가장 낮을 일치율을 보여주었다고 합니다. (298개 중 20개가 불일치하여 93.3%의 일치율)

그래서 Lurie Molecular Diagnostics Laboratory(저자들의 소속 기관)은 VEP를 사용하기로 하였다고 논문에 언급하긴 했는데 진짜 VEP를 사용하고 있는지 ANNOVAR나 Alamut를 몰래 사용하고 안하는지는 제가 알 방법이 없네요

여튼 NGS의 발달로 말미암아 WGS를 하면 400만개, WES를 하면 ~2만개 정도의 변이들을 탐지할 수 있게 되었죠. 그래서 이전에는 변이를 하나하나 탐지하는게 병목점이었다면 이제는 탐지된 변이를 정확하게 판독 할 수 있도록 annotation을 하는 것이 더 중요하고 병목점이 되었다는 것은 누구나 부인하지 못할 것입니다.

- 물론 최근에는 AI/머신러닝의 발달로 annotation 단계에서도 괄목할만한 신속 정확한 결과를 바라볼 수 있지 않을까 합니다. -

이런 이유로 Lurie Molecular Diagnostics Laboratory에서도 이전에는 Alamut를 사용하고 있었는데 라이센스 문제등 효율적인 문제가 부각되어 상용 tool들과 오픈 소스인 VEP간의 annotation 결과 일치도 테스트를 해보게 되었다고 합니다.

그렇다면 비교를 하기위해서는 정답이 있는 문제지가 있어야 되겠죠?
그래서 이전에 Lurie Molecular Diagnostics Laboratory에서 진행되고 큐레이션 되었던 191개 유전자에 있는 298개 변이를 테스트 세트로 했다고합니다.

3개의 annotation tools을 비교하기 위한 vcf를 준비해서 각각 분석을 진행하였다고 합니다.

그래서 확인한 결과 298개 중 278개 변이는 3개 tool에서 모두 동일하게 확인되었고, 그 중 VEP와 Alamut는 99% 일치 하였으나, ANNOVAR의 경우 20개가 불일치 하였다고 합니다. 298개 중 278개 변이가 3개 tools에서 동일하게 나온 이유가 ANNOVAR가 제대로 분석을 하지 못해서였네요.. 

VEP는 298개중 297개를, Alamut는 298개중 296개를 올바르게 annotation을 하였고, ANNOVAR은 위에서 언급한대로 278개만 올바르게 annotation을 하였다고 합니다.

조만간 누군가 고도화된 AI/머신러닝을 탑재한 annotation tool을 출시하면 새바람이 불지 않을까합니다.

그때까지 밥벌이는 해보는걸로 :)

출처: @ye._.vely618

16S rRNA에서 V3/4와 V4/5는 대체 얼마나 다르지?

정확히 얘기하자면 북극해의 해양 생태계의 미생물 군집을 연구할 때는 16S rRNA의 어느 variable region을 사용하는게 좋을까? 되겠습니다.

Comparison of Two 16S rRNA Primers (V3–V4 and V4–V5) for Studies of Arctic Microbial Communities

doi: 10.3389/fmicb.2021.637526

예전부터 microbiome, metagenome연구할 때 항상 언급되는 내용이긴 합니다.
엄밀히 얘기하면

1. 박테리아 genome full sequence가 제일 좋아요
2. 안되면 full lenght 16S rRNA가 좋아요
3. 안되면 그냥 본인이 이거다 싶은거 쓰세요. 다른사람이 무엇을 쓰든지

여튼 이 논문은 빠른 온난화로인해 북극해의 해양 생태계가 어떻게 변화하는지 확인해보고자 1년여동안 모니터링한/샘플링한 데이터를 분석해봤는데, 지금까지 우리가 대중적으로 사용하고 있었던 16S rRNA의 V34가 진짜 golden standard인가? 우리 한번 생각해봐야하지 않겠나? 아니면 적어도 북극해의 미생물 분석 할 때는 (우리가 해봤을때는) 16S rRNA의 V34보다는 V45가 더 적합한것 같아요를 얘기하고 있는 논문되겠습니다.

여기서 얘기하고 있는 16S rRNA의 V34는 어디고 V45는 어디냐?

16S rRNA는 >여기< 참고하시면 잘 나와있습니다. 그리고 그중 V34와 V45는 어디냐?

V34는 341(F)에서 785(R)까지, V45는 515(F-Y)에서 926(R)까지라고 하네요

사실 범용적으로 사용하는 primer 위치들이 연구팀들마다 100% 동일하지는 않습니다. 살짝씩 다를 수 있으니 이 부분도 잘 확인하시면 좋을 것 같습니다.

그 이유는 이 논문에서도 언급되었듯이 지금까지 지금까지 연구가 잘 되어오지 않았던 곳(여기서는 북극해)에서는 어떤 variable region이 종들을 더 잘 구분하는지, 어떤 범용 primer set이 더 잘 작동하는지 정확히 모르기 때문에 그렇습니다. 반대로 사람의 대변, 구강과 같이 이미 수년동안 연구를 통해 실험 방법이 정립된 경우에는 그냥 기존 방법대로 하시면 되겠습니다.

그래서 이 논문의 결론은 북극해와 같이 아직 생태계가 연구되지 않은 환경에 대해서 미생물 군집 연구를 위해서는 V45 primer set을 사용하는 것이 좋다고 하였습니다.

근데 진짜 그럴까요?

논문에서도 나오지만 결론에서 북극해의 미생물 군집 연구를 위해서는 V45가 좋은데, 그 이유가 다른 미생물 군집 검출에 영향을 끼치지 않기 때문이고, archaea도 검출 가능하기 때문인데, V45와 함께 V34를 혼용해서 사용하면 더 좋지 않을까하는 생각이네요

그리고 사족으로 일부 샘플에서 현미경으로 셀 카운팅을 했는데 그 결과가 NSG와 차이가 있었고, 그 이유가 현미경 정량의 한계라고 얘기를 하였지만 꼭 그럴까하는 생각도, NGS의 한계일 수 도 있다는 생각은 >여기<를 보시면 알게 된다는..

그럼 다시 또 재미있는 이야기거리를 가져와 보도록 하겠습니다.

출처: @ye._.vely618

NCBI기반의 분류데이터를 손쉽게 다루는 방법

NCBI의 taxonomy 데이터는 드려다 보신 분들은 아시겠지만 환장의 도가니라고 할 수 있죠

그래서 보다 못한 호주의 어느 용자께서 NCBI의 taxonomy 데이터를 처리할 수 있는 스크립트를 개발하셔서 github에 올려주셨습니다. 물론 논문도 투고하셨고요

이름하여 ncbi-taxonomist, NCBI 분류학자라니.. Orz

Collecting and managing taxonomic data with NCBI-taxonomist

doi: https://doi.org/10.1093%2Fbioinformatics%2Fbtaa1027

여튼 재미있는 기능 중 하나가 NCBI의 nucleotide이든 protein이든 accession을 입력하면 이 accession의 taxonomy 정보를 알려준다는 것입니다.

물론 NCBI 분류학자답게 NCBI의 taxonomy ID과 종 이름(약간의 오타가 있어도, 그 오타가 NCBI에 등록되어 있다면)로도 검색할 수 있습죠.

accession 정보를 이용하여 taxonomy 정보를 파악하는게 생각보다 번거로운 작업인데 ncbi-taxonomist에서 명령어 한번 때려주면 호로록 검색해서 결과를 알려줍니다.

여튼 오늘은 간단한 기능을 보여주는 tool을 소개하였는데
밤새 태풍에 무탈하시기 바랍니다. :)

출처: @ye._.vely618

microbiome 시퀀싱 데이터는 얼마나 잘라내야 결과가 좋을까? for DADA2

요즘 QIIME2를 뒤적이고 있는 차에 쓰임이 많아 보이는 논문이 하나 있어서 투적해봅니다. (물론 greengene2만큼일련지는...)

Trimming conditions for DADA2 analysis in QIIME2 platform

doi: https://doi.org/10.11620/IJOB.2021.46.3.146

사실 QIIME2를 사용할 때뿐만 아니라 metagenome 분석을 할 때 한번은 짚고 넘어가야 하는 내용을 다루고 있어서 거쳐야 하는 단계를 가볍게 넘어가게 할 수 있지 않을까 합니다.

바로 metagenome분석시 qiime2에서 DADA2를 이용한 최적의 read trimming 조건 찾기 입니다.

metagenome 연구를 할 때 일반적으로 일루미나 플랫폼의 V3/4 region을 target으로 시퀀싱을 진행하게 됩니다. 16S rRNA가 종 동정에 많이 사용되고 16S rRNA의 가변 영역인 V1~V9중 해상도가 괜찮은 부분인 V3/4라고 연구되어 있기 때문에 일반적으로 많이 사용하고 있죠

V3/4은 대략 440bp정도이므로 안타깝게도 일루미나의 한쪽 read만으로는 V3/4 영역을 커버할 수가 없습니다. 그래서 pair로 짝을 이뤄 중간에 overlap되게 하여 시퀀싱을 진행하고 overlap되는 서열을 활용하여 merged/stitch 하게 됩니다.

이때 Read1에서는 얼마나 잘라내고 Read2에서는 얼마나 잘라내야지 내 피 같은 연구비를 들여서 생산한 데이터를 최대로 활용하면서 좋은 데이터를 확보할 수 있을까? 가 중요하게 됩니다.

그래서 이 연구팀은 QIIME2의 DADA2를 사용하여 Read1과 Read2를 얼마나 trimming해야지 내 데이터에서 좋은 결과를 뽑아낼 수 있는지에 대한 다양한 실험을 통해 확인하였습니다.

QIIME2에는 DADA2말고 deblur도 있는데 delbur는 왜 안 했어? 라고 하신다면 안타깝게도 deblur는 single read에서 작동된다고 되어 있으니 deblur 결과가 궁금하신 분께서는 직접 해보시는 것도 좋은 선택지 같습니다. :)

여튼 Read1과 Read2의 여러 수치의 trimming 조건과 trimming후 read merge/stitch 이후 chimera 서열로 보이는 데이터의 양, 그리고 trimming에 따라 얻어진 데이터의 미생물의 풍부도(Alpha Diversity)까지, 세심하게 trimming에 따른 결과 영향까지 확인해서 논문에 실어주었네요

사실 빡빡 trimming해서 좋은 quality base들만 남겨 논들 read merge/stitch가 되지 않고, 죄다 chimera라고 나와버리면 무용지물이다 보지 trimming 이후에 trimming의 영향에 대해서도 함께 평가해서 적절한 trimming 지점을 제안해주고 있습니다. 

결과적으로 Read1은 1사분위의 read quality가 Q20가 되면 이제 그 위치부터는 헤어져야 하고, Read2는 Read1과 overlap되는 길이가 16bp이상만 되도록 조절(trimming)해주면 결과에 나쁜 영향을 미치지 않는 -개인적으로는 망하지는 않는 조건이지 않을까 합니다- trimming 조건이라고 얘기하고 있습니다.

그럼 다음에 또 재미있는 내용으로 찾아와 보도록 하겠습니다.

출처: @ye._.vely618

ncbi 횽아들은 어디까지 만들어 낼 것인가

이것저것 작업하면서

ncbi tool들을 다시 사용하고 있는데..

훗.. 역시 우리 ncbi 훃아들의 위대함을 다시 한번 느꼈다는...

NCBI BLAST에서 taxonomy로 제한 거는 기능을 당연히 stand-alone에서도 사용할 수 있는데 NCBI의 -taxid의 숨은 함정이 종 수준의 taxid만 제한 걸 수 있다는..

(근데 써보면 종 수준의 taxid만 제한이 걸리는지 갸우뚱 거리긴 함.. )

여튼 종 수준의 taxid만 제한할 수 있다는 것이 무엇이냐면..

종보다 상위 class의 taxid인 Enterobacterales의 taxid를 사용하면 정상적으로 작동을 안하게 된다는 말씀.

그러므로 NCBI BLAST 프로그램을 다운 받았을 때 함께 있는 get_species_taxids.sh를 활용하면 이 문제를 피해갈 수 있다고 합니다.

사실 최근까지 get_species_taxid.sh가 왜 있는지 관심은 없을 뿐더러
왜 쓰잘떼기 없는 shell script는 왜 넣어놨는지 했다는 ㅎㅎ 

여튼 언제나 NCBI 훃님들께 감사인사를... :)

참고 URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK569846/

출처: @ye._.vely618

왕의 귀환, greengene2

어이쿠... 기억속에 잊혀져 있던 database가 우리 곁으로 다시 돌아왔네요

옛날에 metagenome 한번 해봤으면 썼었던 바로 그 db, greengene이 버전업 해서

greengene2으로 아래 논문으로 돌아왔습니다.

Greengenes2 unifies microbial data in a single reference tree

역시 우리 Rob훃아가 찬밥 신세로 있었던 greengeen을 멱살 잡고 끌고 온듯합니다.

단순히 greengene의 빈약했던 taxonomy정보만 벌크업 한것이 아닌 16S rRNA와 shotgun metagenome 결과를 비교할 수 있도록 개선했다고 합니다.

여튼 metagenome 하면서 다들 느낀 점은 시퀀싱 방법과 db가 바뀔 때 마다 결과가 왜 다르지 아니겠습니까? 이 문제를 (어느정도)해결하지 않나 싶습니다.

꼼꼼하게 보지는 않았지만 현존하는 종 db들을 싹싹 털었던듯 싶네요

WoL(Web of Life), LTP(Living Tree Project)등의 db에서 확보가능한 full length 16S rRNA 서열을 긁어모았고 쿵짝 쿵짝 하고 taxonomy는 통일을 하기 위해 NCBI체계를 따르는 LTP 정보를 GTDB(Genome Taxonomy DataBase)에 통합하였다고 합니다.  curation차이로 인해서 LTP와 GTDB간의 차이가 발생하고 종의 종보들이 누락되어 있는 것들이 있다보니 데이터가 더 풍부한 GTDB에 LTP 정보들을 통합하였다고 하네요.
(개인적으로 NCBI taxonomy 체계를 사용하고 있는데...)

여튼.. 거의 10년만의 greengene의 귀환 논문이고 (단순히) 데이터만 많았던 siliva가 긴장좀 하겠네요 ㅎㅎ 

더 자세하게 읽어 봐야하는데...

기쁜 마음에 포스트 먼저 훗..

출처: @ye._.vely618

The next giant step for microbes

최근 페링과 세레스에서 개발한 C. difficile 관련 치료제가 FDA의 승은을.. 아니 승인 받은 미생물 치료제들이 세상에 나오고 있고, 최근에는 세레스에서 먹는 장내 미생물 치료제까지... ㄷㄷㄷ

그런의미에서 microbes관련 짧은 글 하나가 눈에 보여 살짝쿵 글하나 올려봅니다.

The next giant step for microbes

C. difficile 치료제가 FDA 승인을 받은 시점에서 microbes가 가야하는 그곳은 어디인가?

이제 다들 잘 알고 있다 싶이 장 속의 미생물을 비롯해서 피부, 구강, 질, 폐 등 다양한 기관 -다분히 청정 또는 무균 일 것이라고 생각되는 장기들-에 우리와 함께 살고 있는 수많은 미생물들이 있습니다.

그 중 장 속에 압도적으로 많은 다양하고 많은 미생물들이 존재하고 신경 발달과 약물에 대한 치료의 효과에도 영향을 미치고 있는 엄청 중요한 존재인것을 이제 연구를 통해 알아가고 있습니다.

그래서 많은 바이오 기업들이 장내미생물을 활용한 약물 또는 건강을 개선하는데 사용할 수 있는 보조제나 치료제들을 개발하기 위해 노력하고 있습니다.

그러나 아직 장내미생물이 건강에 지대하고 중요한 역할을 하는 것에 비해 알려진것이 생각보다 많진 않는것 같습니다. 또한 약물이나 치료제로써 사용하기 위해서 안전성도 중요한 문제이다 보니 이런 부분들에 대해서도 아직 갈길이 멀지만 그래도 또 걷다보면 좋은 일이 있지 않을까 합니다.

간만에 간략한 글 하나 공유해보았습니다.

세상에는 할일이 참 많다는 것은 변하지않는 진리인듯 합니다. :)

출처: @ye._.vely618