16S rRNA에서 V3/4와 V4/5는 대체 얼마나 다르지?

정확히 얘기하자면 북극해의 해양 생태계의 미생물 군집을 연구할 때는 16S rRNA의 어느 variable region을 사용하는게 좋을까? 되겠습니다.

Comparison of Two 16S rRNA Primers (V3–V4 and V4–V5) for Studies of Arctic Microbial Communities

doi: 10.3389/fmicb.2021.637526

예전부터 microbiome, metagenome연구할 때 항상 언급되는 내용이긴 합니다.
엄밀히 얘기하면

1. 박테리아 genome full sequence가 제일 좋아요
2. 안되면 full lenght 16S rRNA가 좋아요
3. 안되면 그냥 본인이 이거다 싶은거 쓰세요. 다른사람이 무엇을 쓰든지

여튼 이 논문은 빠른 온난화로인해 북극해의 해양 생태계가 어떻게 변화하는지 확인해보고자 1년여동안 모니터링한/샘플링한 데이터를 분석해봤는데, 지금까지 우리가 대중적으로 사용하고 있었던 16S rRNA의 V34가 진짜 golden standard인가? 우리 한번 생각해봐야하지 않겠나? 아니면 적어도 북극해의 미생물 분석 할 때는 (우리가 해봤을때는) 16S rRNA의 V34보다는 V45가 더 적합한것 같아요를 얘기하고 있는 논문되겠습니다.

여기서 얘기하고 있는 16S rRNA의 V34는 어디고 V45는 어디냐?

16S rRNA는 >여기< 참고하시면 잘 나와있습니다. 그리고 그중 V34와 V45는 어디냐?

V34는 341(F)에서 785(R)까지, V45는 515(F-Y)에서 926(R)까지라고 하네요

사실 범용적으로 사용하는 primer 위치들이 연구팀들마다 100% 동일하지는 않습니다. 살짝씩 다를 수 있으니 이 부분도 잘 확인하시면 좋을 것 같습니다.

그 이유는 이 논문에서도 언급되었듯이 지금까지 지금까지 연구가 잘 되어오지 않았던 곳(여기서는 북극해)에서는 어떤 variable region이 종들을 더 잘 구분하는지, 어떤 범용 primer set이 더 잘 작동하는지 정확히 모르기 때문에 그렇습니다. 반대로 사람의 대변, 구강과 같이 이미 수년동안 연구를 통해 실험 방법이 정립된 경우에는 그냥 기존 방법대로 하시면 되겠습니다.

그래서 이 논문의 결론은 북극해와 같이 아직 생태계가 연구되지 않은 환경에 대해서 미생물 군집 연구를 위해서는 V45 primer set을 사용하는 것이 좋다고 하였습니다.

근데 진짜 그럴까요?

논문에서도 나오지만 결론에서 북극해의 미생물 군집 연구를 위해서는 V45가 좋은데, 그 이유가 다른 미생물 군집 검출에 영향을 끼치지 않기 때문이고, archaea도 검출 가능하기 때문인데, V45와 함께 V34를 혼용해서 사용하면 더 좋지 않을까하는 생각이네요

그리고 사족으로 일부 샘플에서 현미경으로 셀 카운팅을 했는데 그 결과가 NSG와 차이가 있었고, 그 이유가 현미경 정량의 한계라고 얘기를 하였지만 꼭 그럴까하는 생각도, NGS의 한계일 수 도 있다는 생각은 >여기<를 보시면 알게 된다는..

그럼 다시 또 재미있는 이야기거리를 가져와 보도록 하겠습니다.

출처: @ye._.vely618

NCBI기반의 분류데이터를 손쉽게 다루는 방법

NCBI의 taxonomy 데이터는 드려다 보신 분들은 아시겠지만 환장의 도가니라고 할 수 있죠

그래서 보다 못한 호주의 어느 용자께서 NCBI의 taxonomy 데이터를 처리할 수 있는 스크립트를 개발하셔서 github에 올려주셨습니다. 물론 논문도 투고하셨고요

이름하여 ncbi-taxonomist, NCBI 분류학자라니.. Orz

Collecting and managing taxonomic data with NCBI-taxonomist

doi: https://doi.org/10.1093%2Fbioinformatics%2Fbtaa1027

여튼 재미있는 기능 중 하나가 NCBI의 nucleotide이든 protein이든 accession을 입력하면 이 accession의 taxonomy 정보를 알려준다는 것입니다.

물론 NCBI 분류학자답게 NCBI의 taxonomy ID과 종 이름(약간의 오타가 있어도, 그 오타가 NCBI에 등록되어 있다면)로도 검색할 수 있습죠.

accession 정보를 이용하여 taxonomy 정보를 파악하는게 생각보다 번거로운 작업인데 ncbi-taxonomist에서 명령어 한번 때려주면 호로록 검색해서 결과를 알려줍니다.

여튼 오늘은 간단한 기능을 보여주는 tool을 소개하였는데
밤새 태풍에 무탈하시기 바랍니다. :)

출처: @ye._.vely618

microbiome 시퀀싱 데이터는 얼마나 잘라내야 결과가 좋을까? for DADA2

요즘 QIIME2를 뒤적이고 있는 차에 쓰임이 많아 보이는 논문이 하나 있어서 투적해봅니다. (물론 greengene2만큼일련지는...)

Trimming conditions for DADA2 analysis in QIIME2 platform

doi: https://doi.org/10.11620/IJOB.2021.46.3.146

사실 QIIME2를 사용할 때뿐만 아니라 metagenome 분석을 할 때 한번은 짚고 넘어가야 하는 내용을 다루고 있어서 거쳐야 하는 단계를 가볍게 넘어가게 할 수 있지 않을까 합니다.

바로 metagenome분석시 qiime2에서 DADA2를 이용한 최적의 read trimming 조건 찾기 입니다.

metagenome 연구를 할 때 일반적으로 일루미나 플랫폼의 V3/4 region을 target으로 시퀀싱을 진행하게 됩니다. 16S rRNA가 종 동정에 많이 사용되고 16S rRNA의 가변 영역인 V1~V9중 해상도가 괜찮은 부분인 V3/4라고 연구되어 있기 때문에 일반적으로 많이 사용하고 있죠

V3/4은 대략 440bp정도이므로 안타깝게도 일루미나의 한쪽 read만으로는 V3/4 영역을 커버할 수가 없습니다. 그래서 pair로 짝을 이뤄 중간에 overlap되게 하여 시퀀싱을 진행하고 overlap되는 서열을 활용하여 merged/stitch 하게 됩니다.

이때 Read1에서는 얼마나 잘라내고 Read2에서는 얼마나 잘라내야지 내 피 같은 연구비를 들여서 생산한 데이터를 최대로 활용하면서 좋은 데이터를 확보할 수 있을까? 가 중요하게 됩니다.

그래서 이 연구팀은 QIIME2의 DADA2를 사용하여 Read1과 Read2를 얼마나 trimming해야지 내 데이터에서 좋은 결과를 뽑아낼 수 있는지에 대한 다양한 실험을 통해 확인하였습니다.

QIIME2에는 DADA2말고 deblur도 있는데 delbur는 왜 안 했어? 라고 하신다면 안타깝게도 deblur는 single read에서 작동된다고 되어 있으니 deblur 결과가 궁금하신 분께서는 직접 해보시는 것도 좋은 선택지 같습니다. :)

여튼 Read1과 Read2의 여러 수치의 trimming 조건과 trimming후 read merge/stitch 이후 chimera 서열로 보이는 데이터의 양, 그리고 trimming에 따라 얻어진 데이터의 미생물의 풍부도(Alpha Diversity)까지, 세심하게 trimming에 따른 결과 영향까지 확인해서 논문에 실어주었네요

사실 빡빡 trimming해서 좋은 quality base들만 남겨 논들 read merge/stitch가 되지 않고, 죄다 chimera라고 나와버리면 무용지물이다 보지 trimming 이후에 trimming의 영향에 대해서도 함께 평가해서 적절한 trimming 지점을 제안해주고 있습니다. 

결과적으로 Read1은 1사분위의 read quality가 Q20가 되면 이제 그 위치부터는 헤어져야 하고, Read2는 Read1과 overlap되는 길이가 16bp이상만 되도록 조절(trimming)해주면 결과에 나쁜 영향을 미치지 않는 -개인적으로는 망하지는 않는 조건이지 않을까 합니다- trimming 조건이라고 얘기하고 있습니다.

그럼 다음에 또 재미있는 내용으로 찾아와 보도록 하겠습니다.

출처: @ye._.vely618

ncbi 횽아들은 어디까지 만들어 낼 것인가

이것저것 작업하면서

ncbi tool들을 다시 사용하고 있는데..

훗.. 역시 우리 ncbi 훃아들의 위대함을 다시 한번 느꼈다는...

NCBI BLAST에서 taxonomy로 제한 거는 기능을 당연히 stand-alone에서도 사용할 수 있는데 NCBI의 -taxid의 숨은 함정이 종 수준의 taxid만 제한 걸 수 있다는..

(근데 써보면 종 수준의 taxid만 제한이 걸리는지 갸우뚱 거리긴 함.. )

여튼 종 수준의 taxid만 제한할 수 있다는 것이 무엇이냐면..

종보다 상위 class의 taxid인 Enterobacterales의 taxid를 사용하면 정상적으로 작동을 안하게 된다는 말씀.

그러므로 NCBI BLAST 프로그램을 다운 받았을 때 함께 있는 get_species_taxids.sh를 활용하면 이 문제를 피해갈 수 있다고 합니다.

사실 최근까지 get_species_taxid.sh가 왜 있는지 관심은 없을 뿐더러
왜 쓰잘떼기 없는 shell script는 왜 넣어놨는지 했다는 ㅎㅎ 

여튼 언제나 NCBI 훃님들께 감사인사를... :)

참고 URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK569846/

출처: @ye._.vely618

왕의 귀환, greengene2

어이쿠... 기억속에 잊혀져 있던 database가 우리 곁으로 다시 돌아왔네요

옛날에 metagenome 한번 해봤으면 썼었던 바로 그 db, greengene이 버전업 해서

greengene2으로 아래 논문으로 돌아왔습니다.

Greengenes2 unifies microbial data in a single reference tree

역시 우리 Rob훃아가 찬밥 신세로 있었던 greengeen을 멱살 잡고 끌고 온듯합니다.

단순히 greengene의 빈약했던 taxonomy정보만 벌크업 한것이 아닌 16S rRNA와 shotgun metagenome 결과를 비교할 수 있도록 개선했다고 합니다.

여튼 metagenome 하면서 다들 느낀 점은 시퀀싱 방법과 db가 바뀔 때 마다 결과가 왜 다르지 아니겠습니까? 이 문제를 (어느정도)해결하지 않나 싶습니다.

꼼꼼하게 보지는 않았지만 현존하는 종 db들을 싹싹 털었던듯 싶네요

WoL(Web of Life), LTP(Living Tree Project)등의 db에서 확보가능한 full length 16S rRNA 서열을 긁어모았고 쿵짝 쿵짝 하고 taxonomy는 통일을 하기 위해 NCBI체계를 따르는 LTP 정보를 GTDB(Genome Taxonomy DataBase)에 통합하였다고 합니다.  curation차이로 인해서 LTP와 GTDB간의 차이가 발생하고 종의 종보들이 누락되어 있는 것들이 있다보니 데이터가 더 풍부한 GTDB에 LTP 정보들을 통합하였다고 하네요.
(개인적으로 NCBI taxonomy 체계를 사용하고 있는데...)

여튼.. 거의 10년만의 greengene의 귀환 논문이고 (단순히) 데이터만 많았던 siliva가 긴장좀 하겠네요 ㅎㅎ 

더 자세하게 읽어 봐야하는데...

기쁜 마음에 포스트 먼저 훗..

출처: @ye._.vely618