Warning Warning BAM header...

Warning: BAM header too large File

TopHat - cufflinks 조합으로 RNAseq을 분석하는 분들 중에서
과연 얼마나 접해보셨을까 하는데요..
혹 수백,수천개의 chr을 가진 genome을 분석하시는 분께서는 보셨을지도..

그렇습니다. 아직 genome project가 완벽하게 완료되지않아
chr이 완벽하게 정리되지 않아 그렇게 길지 않은 scaffold로 존재하고 있는 경우
마주할 수 있는 문제입니다.
BAM header 파일이 너무 커서 즐!! 이라고 내뱉는것입죠

samtools view -H input.bam #bam파일 Header만 print하는 명령어

구글링을 통해 얻은 결론
소스코드 수정후 새로 컴파일을 해야한다는 것!
(아놔... precompile된것만 편하게 사용하고 있었는데...
 소스 컴파일한다고 더 제대로 작동한다는 보장도 없는데 말이죠 아놔;;; )

여하튼 cufflink 소스 파일과 필요한 패키지들을 (DNS가 문제인지 외부로 직접은 안붙고
내부만 붙어서 다른 서버에서 다운받아서 복사한 후) 어찌어찌해서 설치 ㅋㅋ
현재까지는 잘 작동있다는 점~
컴파일하는동안 내내 warning이 화면을 도배했다는 점~
이거마저 안되면 난 모르겠다는 점~


cufflinks 패키지 설치시 많은 난관들이 있었지만 구글링을 통해 해결
그 경험을 정리해서 필요한 것과 수정해야 하는것들을 순서대로 다시 정리하자면

1. cmake 설치
 cmake 다운로드
 생각하지도 말고 root로 접속하여
 압축 풀고 폴더 안으로 침투하여
 >./bootstrap
 >make && make install
 을 나비처럼 날아서 타이핑과 엔터를 치면 나도 모르는 사이 설치가 되고 있다는 사실!!


2. boost 설치
 boost 다운로드
 이것 역시 다운로드 후 압축 풀고 root권한으로 접속 하여 설치작업을 진행하는것이 여러모로 건강에 도움이 될 듯 하다.
>cd boost/tools/build/v2/
>./boostrap.sh
>./b2 install
>./bjam #심심하면 이것도 실행을... 아... 기억이.. ㅎㅎ
boost 설치에 대해서는 cufflinks 홈페이지를 참조하는 것도 나쁘지 않는듯
cufflinks 튜토리얼
 root 권한으로 걍 설치하면 BOOST_ROOT path 지정하는게 필요가 있을까 하는 생각도..


3. samtools 설치
 samtools 다운로드
이건 모 설치하는데 크게 어렵지 않는 관계로 걍 본인 계정으로 설치, 그냥 압축 풀고
make 실행시키면 설치될듯합니다.
다만 이후 head파일이나 library파일을 위에서 언급한 tutorial페이지에 나와있는대로
올바른 위치에 복사를 해주어야 정신건강에 좋을듯 하다는 말을 남기면서 다음 단계로 고고씽~!!!


4. eigen 설치
 eigen 다운로드
이것 역시 압축을 해제한 후 계정을 root권한으로 갈아타고
압축 해제한 폴더로 들어가서 서브 디렉토리중 하나인 Eigen 폴더를 통채로
시스템 헤더 파일이 있는 곳으로 복사하면 OK
복사할 디렉토리는 cufflinks 튜토리얼을 참고하시길..


5. cufflinks 설치
 cufflinks 다운로드
마지막으로 대미를 장식할 오늘의 주인공 cufflinks
이것은 꼭 root 권한으로 설치 안해줘도 상관없다.
각자 개인 계정에 압축을 풀고 설치 과정을 시작하면 된다.
단 이 글에서 문제가 되었던 위험 요소를 제거를 하기 위해서 파일하나를 수정할 필요가 있다. :)
>cd cuffinks-2.x.x
>vi src/hits.cpp
MAX_HEADER_LEN = 4 * 1024 * 1024 로 되어 있는 것을
각자 genome 사정에 맞게 수정하면 된다. 
본인의 경우 MAX_HEADER_LEN = 128 * 1024 * 1024
>./configure --prefix=/path/to/cufflinks/install
(위에서 root권한을 사용해서 기본설정으로 설치를 안해주었다면
 --with-boost/--with-eigen/--with-bam 경로를 설정해 주어야 한다.
>make && make install


5단계를 거치고 나서 cufflinks가 설치가 완료되면
이제 새로 컴파일한 실행 파일로 실행하면 일단 warning을 뱉어내지 않으면서
일을 시작할 것이다.

중간에 세그먼트 폴트 에러를 뱉어내면서 죽지 않기를 바랄뿐이다. :)

SFF 파일은 어떻게 작업을 해야하나...

아....

딱히 인연이 없던 454 파일을 작업할 기회가 생겨서..
다음과 같이 스크립트를 좀 작성했습니다.

454에서 제공하는 Data analysis를 이용하지 않아서 좀 거시기합니다.
(Homopolymer trimming은 제공하지 못하고 있습니다. ㅎㅎ)

convertsff.py 

SFF파일을 fastq 혹은 fasta, qual 파일로 변환하는 스크립트
fastq로 변환하는 경우 illumina 1.3/1.5+ score로 변환 됩니다.
biopython이 설치되어 있어야 합니다.


SFF_Filter.py

illumina 데이터와는 일단 길이가 차이가 나니.... ㅎㅎ
filtering 스크립트를 간단히 만들었습니다.
cutoff base quality와 cutoff read length는 사용자가 설정 할 수 있게 하였습니다. :)
그리고 N의 포함 정도와 cutoff base quality 포함 정도는 고갱님의 의견을 반영하여
박하지 않게 설정해서 fixed시켜 놨습니다.
맘대로 수정하셔도 무방합니다. :)
다만 더 좋은 옵션이나 방법으로 업데이트 하셨다면 공유를 해주시면 더더욱 감사드리겠습니다.

데이터 변환 및 필터링이 끝나고 나면
QC를 해봐야 겠죠?

좀 간단히 결과를 이쁘게 그려주는게 어디 없을까 하고 있었는데
prinseq라는 프로그램이 있어 잠시 사용해봤습니다.
사용방법은 어렵지 않아요~ :)


Base Quality가 Phred +33인 경우

perl prinseq-lite.pl -verbose -fastq <input.fq> -graph_data <output.gd> -out_good null -out_bad null

Base Quality가 Phred +64인 경우

perl prinseq-lite.pl -verbose -fastq <input.fq> -graph_data <output.gd> -phred64 -out_good null -out_bad null

Quality Check 결과물을 Html로 확인하는 경우
perl prinseq-graphs.pl -i <output.gd> -html_all -o <output_name>

Quality Check 결과물을 png로 확인하는 경우
perl prinseq-graphs.pl -i <output.gd> -png_all -o <output_name>





추후에 시간이되면
Data analysis 프로그램을 설치해서 작업하는 단계나 방법에 대해서 설명하도록 하겠습니다. 그리고 추가적으로 NGS QC toolkit을 사용해서 QC하는 것도..
S대 L모군이 찾아논건데 괜찮아보여서 테스트 해볼까 합니다.
Illumina 외에 454도 지원하고 제일 매력적인건 multi-thread를 지원한다는것!!

모 여하튼...

다음기회에~ :)

TopHat을 바라볼때 중요한것

Read Manual!!! 

TopHat manual


사실 알고리듬 모르니...
라고 생각한다면.. 모 어쩔수 없고?? ㅎㅎ :)

하지만 무엇인가 알고 돌리는것과 모르고 자연에 출판된 protocol만 따라 돌리는것에는
많은 차이가 있으니..

T사의 K박사님의 정보로 TopHat 2.0.5를 허벌나게 사용중에 있습니다.
-한달 전만해도 TopHat 2.0.4를 사용중에 있었습니다.
-그 석달 전?? 반년 전 만해도 TopHat 1.0.3?을 사용하고 있었다는...


여하튼...
이번에 TopHat 2.0.5를 사용하면서 기존과 다르게 사용한 옵션이 있으니

--read-realign-edit-dist


그리고 사용안한 옵션도 있으니

-G / --GTF

옵션 이름 만으로도 대충 감들 잡으셨을 테니 옵션에 대한 설명은 패스하고,
왜 -G/--GTF를 사용안하냐?
(엄밀히 말하자면 known gene과 prediction gene의 문제..)
이 옵션을 사용하게 되면 --read-realign-edit-dist를 active시킨 의미가 없어지기 때문입니다.

이번에 --read-realign-edit-dist를 사용하면서 running 시간이 dramatically하게 증가하는 것을 경험했는데, S대 L군의 말로는 자기는 running 시간이 차이가 많이 나지 않는 다는 것!!
둘의 차이가 모였냐하니.. -G옵션을 사용하고 안하고 차이였습니다.

-G 옵션 설명에 gtf 정보를 사용하여 transcript sequence를 뽑아내서 거기에다가만 mapping을 한다는 것;; (역시 지도 교수님은 위대하다는 ㅎㅎ, 본인의 경우 해당 페이지를 몇번을 보고도 그냥 지나쳤었는데.. ㅎㅎ)

여하튼... -G를 사용하고 --read-realign-edit-dist 옵션을 사용하는것도 의미가 있겠지만 -G를 사용하지 않는게 더 좋은 결과를 낼 수 있지 않을까하는 단상을 끄적여 봅니다.

각자 실험하는 개체에 따하 gtf 사용여부를 판단하시면 되고 어떤 결과를 보느냐에 따라
--read-realign-edit-dist를 사용 여부를 결정하시면 됩니다.

제 경우 이게 그냥 자연에 출판된 protocol에 나온 방법보다 좋을것 같다는 생각이 듭니다.
이제 조만간 결과가 나오니 확인해보고 다시 글을 쓰도록 하겠습니다.


그리고 아시다시피 TopHat을 돌렸으면 cufflink도 돌리셔야죠.. ㅎㅎ :)
(아님 말고 ㅎㅎㅎㅎ )


ps. 누누이 말하지만 Human/Mouse는 default와 자연에 출판된 protocol이 甲이 맞는듯 합니다. ㅎㅎ 

그렇게 좋은 PacBio에 손이 안가는 이유...

"진정 우리꺼는 여러분들에게 좋으면 좋지
해를 안끼친다는.... "

- PacBio 본사 시니어 연구원느님의 발표


그렇게해도 PacBio는 정이 안간다는 ㅎㅎ

Illumima/ Life Tech.는 "우리거 좋아, 한번 써봐" (라는 우리꺼 안쓰면 니네 좀 후회할껄?)라는 느낌이라면,

PacBio는 "이번 논문에도 나왔듯이 우리꺼쓰면 울트라 캡숑 짱 따봉 좋아요 한번 써보세요" (라는 느낌?)

점심먹으면서 K군과 담소를 나누면서
Microorganism/ Meta genome 분야에서는 454에 비해 확실히 경쟁력이 있는데
(미국에서 1K Fungal genome project에서 PacBio를 사용하고 있다고 합니다.)
그외에는 과연 얼마나 경쟁력이 있는지... 잘 모르겠다는.... ㅎㅎㅎㅎ

그리고 제일 중요한건,

개인적으로 PacBio를 선듯 사용하지 못하는 이유는
비용문제에 대해서 확실한 해결책을 제시하지 못하고 있다는것도 큰 문제인듯..

PacBio를 가장 괴롭히는 것이 Error ratio문제인데
어차피 random error니깐 depth가 많으면 된다는 점~

다만, 다른 시퀀서의 QV를 맞추기위해 그 depth만큼
시퀀싱을 하면 비용 증가로 이어진다는것.

지구상에 재료비에 제한을 두지 않고 풍족하게 사용가능한 랩을 제외하고
사용 가능한 QV에 맞는 depth만큼 시퀀싱할 랩 아니면 ㅎㄷㄷㄷ

모 어차피 시퀀싱 업체에 맡기면 되니깐~  :)

ps. 약간의 글 수정이 있었습니다.
ㄴㅈㅊ에 다니는 지인의 염려가 있어 약간 수정을 하였습니다.
기술적인 부분이 아닌 현실적인 문제인 비용문제에 대해서 언급했으니
모 문제가 있겠냐마는.. ㅎㅎㅎㅎ

왜 샘플수가 400이어야 했는가.

왜 300을 하지?? ㅋㅋ

사실 KOGO학회 이전에
창범형님께서 facebook 담벼락에 공지하지 않았다면
그냥 지나갔을 법한 일이었습니다.

사업 취지와 목표, 방법에 대해서 주저리주저리 작성해놓은 문서 보면서
그냥 들었을만하 의구심..
물론 학회장에서 피뽑는다고 해서 신기한 마음에 걍 했지만 서도.. ㅎㅎ :)

샘플수집이 걍 지원자 400명?
2배수 3배수 뽑고 선별이나 무작위 추첨해서 분석하는것도 괜찮을듯한데..
그리고 지역별로도 차이가 날텐데.. 흠..
그리고 400명은 어떻게 나온건데?

궁금한점이 몇가지 들었죠 ㅎㅎㅎㅎ

근데 생각하다보니 이거 구상한 분들도 나랑 똑같이 귀차니즘이구만?
하고 생각을 마무리하게 됐지요 ㅎㅎㅎㅎ

그 이유..

1. 샘플 수집
이런 류의 사업을 진행하때 샘플수집을 어떻게 하는지 잘 모르겠지만..
안내문을 보면 서울에서 400명의 지원자를 받아서 사업을 진행하는 것 같이 보였는데,
이런 사업을 걍 지원자만 가지고 진행하는건지.. 좀 궁금하고..
서울에서만 진행하는건지 좀.... 그랬는데..

서울과 수도권을 포함하면 대한민국 절반이니.. 쿨럭;;;
-이거 완전 서울지상주위자로 몰리겠는데;;; 제가 이번에 시민이되서 그런게 아니라구요 ㅋㅋ

2. 대표성
위에서 언급한 수집 방법과 연결된건데...
Koread reference genome사업인데
대한민국을 대표할수있는 유전체가 될려면...??
이북도 해야하는건거 아닌가? 라는 말이 나올수 있습니다. ㅎㅎ
이북을 포함하지 않은 대표서열을 만든다면
지역적안배를 고려해볼만했을텐데
이북을 포함해서 대표서열을 구축하고자 한다면 굳이 지역적으로 나눠서 할 필요가??
ㅎㅎㅎ 어차피 이북에서 샘플을 못구하는데..
이미 이남에 편향되어 있다고 볼수 있지 않나하는 생각이...
그래서 서울에서만 해도 크게 문제가 되지 않고 대표성에도 문제가 될까하는
생각이 들었습니다.
-물론 서울에서 하니 새터민 분들도 참여를 했냐라고 물으신다면...
 아니요 라고 말씀드릴수있습니다. 확률상 서울이 높다 이거죠;;
 그리고 그분들은 이런 과제 있다는거 모르고 사실겁니다.
 저도 창범형님아니었으면 그분들과 똑같이 모르고 지나갔을테죠 ㅎㅎ
ps. 일단 본 과제에 최소한 하나는 이북 서열입니다. (저요 ㅎㅎ)


3. 샘플 숫자
아... 이건 좀...
제 생각이 맞다면 진짜 안습인데;;;
과제란게 한정된 자원으로 진행하다보니.. 쿨럭..
아시겠죠? ㅋㅋㅋㅋ
이것저것 빼고나니 시퀀싱할 비용으로 할수있는 샘플수가 400명
언저리;;;
이렇게 생각하고 싶진 않지만...ㅋㅋㅋㅋ
그리고 지원자로만 채워질 숫자라면 400도 그리 쉬운숫자가 아니었을겁니다.
이바닥에서 놀고있는 저도 창범형님아니었으면 그냥 지나가고
나중에 저런것도 했었구나 라고 할판이었으니깐요;;;; ㅎㅎㅎㅎ


여하튼... 이번 사업으로
M/D/T사 하나는 NGS로 영업이익은 꽤나 날듯(순이익은 아님..  ㅋ)
시퀀서 규모로는 M사가 유력하긴한데..
그리고  추가적으로 K사도???
아니면 걍 국책과제에 클라우드 리소스 무상 대여;;;;
그냥 그렇다고요 쿨럭;;; ㅎㅎㅎㅎ

파일의 포맷을 변환하는데 필요한 것들

내가 아니란 말이닷!!! ㅋㅋ

python에서 Biopython을 이용하여
간단하게 convert하는 샘플 코드를 제공하고 있으니
여러분들도 쉽게 만들수 있어요~ :)
Biopython에서 제공하는 Tutorial 


오늘 문의가 들어온 파일은 sff파일
Roche의 454 GS FLX? sequencing 결과파일로....
ABI와 함께 illumina한테 밀려서 뒷방으로 들어앉은 파일 포맷입니다.
그러나 아직도 쓰는 이유는 read 길이가 길기때문 :)

그렇습니다. PacBio도 Nanopore다 디립다 길게 sequencing해준다는
애들이 있습니다. 그런데 왜 옛날꺼 쓰냐?? PacBio는 base quality가 안습이고,
Nanopore는.... 언제 출시일지 전 잘 모르겠습니다. 업자가 아닌관계로 ㅎㅎ

그래서 위의 길게 sequencing 해준다는 시퀀서를 제외하고는 Roche의 454가 read 길이가 가장 길다고 할 수 있겠습니다. NGS중에선 말이죠

그런데 sff파일을 보려고 하면 문제가 생깁니다.
권모씨께서 문의를 한것이 그것때문인지는 모르겠지만 걍 일반인이
sff파일을 걍 직접 볼수가 없습니다. 왜냐 binary파일이니깐요(sff파일이 binary라고
알고 있는데  직접 다뤄본적이 없어서... ㅎㅎ )

그래서 사람이 볼수 있게 파일을 변환시켜줘야 한다는 겁니다.

convertSff.py

#!/usr/bin/python

import os, sys
from Bio import SeqIO

try:
inputSFF = sys.argv[1]
outputPREFIX = sys.argv[2]

except:
print "Usage: python convertSFF <input.sff> <output_name>"
print ""
exit(1)


SeqIO.convert(inputSFF,"sff","%s.fasta"%(outputPREFIX), "fasta")
SeqIO.convert(inputSFF,"sff","%s.quality"%(outputPREFIX), "qual")
SeqIO.convert(inputSFF,"sff","%s.fastq"%(outputPREFIX), "fastq")

권모씨의 요청으로 급조한 날림 convert python 코드 ㅋㅋ
이 스크립트를 수행하면 세개의 파일이 나오게 될것으로 예상됩니다. ㅎㅎ
안나오면 어쩔수없고... ㅎㅎ


아.. 그리고 사족으로 LT사의 SOLiD의 경우 우리가 알고 있는 서열과 달리
첫 염기 서열만 서열이고 그 다음부터는 A/G/T/C 알파벳이 아닌 숫자로 되어있는데..
이걸 굳이 변환해서 reference geneome에 mapped 작업하지 말라고 합니다.
Re-sequencing하는 경우라면 변환해서 mapping하지 말고 원래 원본 파일 그대로를
input으로 하는 align 프로그램을 사용해서 mapped한 다음에 그 다음 작업을
일반적으로 사용하는 samtools나 GATK같은 프로그램을 사용하라고 합니다.
(다들 알고있는거 한번더 상기 시켜드렸습니다. 혹시 아나요 SOLiD 포맷을 분석하게 될지.. ㅎㅎ)

분석시 raw 파일을 사용해야 하는 이유는 SOLiD만의 월등한 quality 효과를 볼수 있어서
그러지 않겠나하는....  믿거나 말거나 저 혼자만의 생각입니다.. ㅎㅎ
다만, 타사 제품과 다르게 복잡하게 숫자로 표현한건 아니겠죠...
나름의 숨은 뜻이.... 쿨럭.. (설마... 간지용;;;;; )

Re-sequencing이 아닌 denovo일 경우 모 어쩔수 없이 fastq파일로 변환을 해야 하지 않을까 합니다. assembly 프로그램을 작동시키려면 아무래도 SOLiD format보다는 fastq 포맷이
수월하니깐요.. :)

그럼....

Illumina Adapter Sequence

Illumina Sequencing에서 사용되는
Adapter중 TruSeq (분석할때 받는 데이터들이 다 요녀석으로 되어 있어서...) DNA/RNA Adapter Sequence를 확인해서 확인해봤습니다. ㅎㅎ

Type	Sequence
TruSeq Universal Adapter	AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
TruSeq Adapter, Index 1	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq Adapter, Index 2	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGATGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq Adapter, Index 3	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTAGGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq Adapter, Index 4	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGACCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq Adapter, Index 5	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACAGTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq Adapter, Index 6	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCCAATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq Adapter, Index 7	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCAGATCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq Adapter, Index 8	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACTTGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq Adapter, Index 9	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGATCAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq Adapter, Index 10	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTAGCTTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq Adapter, Index 11	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGCTACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq Adapter, Index 12	GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTTGTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

나중에 급할때 찾기 좀 애매해서...
요기다가 급 정리 ㅎㅎ

데이터 받았는데 TruSeq DNA/RNA Adapter인데 Index 12번보다 큰 경우
TruSeq Small RNA Index를 사용하는 것이라고 하네요
기본적인 Adapter sequence는 TruSeq DNA/RNA 인데 Index만 TruSeq Small RNA..
모 그렇다고 합니다. :)

좀더 자세한 Illumina Adapter Sequence에 대해서 알고 싶다면
다음 링크 참조 LINK

Velvet 사용 Tip

작년부터 NGS, NGS 해서 한두번쯤은
많은 NGS 프로그램들을 들어보셨을 것이고
조금이라도 관련되어 있는 일을 하시는 분이라면
이미 많이사용해 보셨을 것이라고 생각됩니다.

오늘은 그중에서 Velvet, sequence assembly 프로그램에 대해서..

Velvet은 de Bruijn graph 알고리듬을 사용했다고 합니다(라고 메뉴얼에 적혀 있습니다.
물어보지 마십시요. 저도 몰라요 ㅠ.ㅜ ).

여하튼 assembly 프로그램은 제가 알고 있는 바로는 크게 두가지
velvet과 같이 graph 알고리듬을 사용하는 프로그램과
아니면 sequence overlap 방법을 사용하는 프로그램이 있습니다.

그중에서 전 velvet이 좋은데 왜냐?
사용하기가 간편해서 입니다. ABySS나 ALLPATH-LG와 같이 복잡미묘하지 않기때문이죠
(간단하기로는 BGI의 SOAPdenovo가 최고봉인듯;;; )
단, velvet의 경우 big size의 genome을 assembly 할때는 고성능 CPU도 중요하지만
대용량 RAM도 함께 준비하시기 바랍니다.
물론 Big Size genome이라서 RAM이 많이 필요 한게 아니라 assembly read 개수가 많기 때문에
대용량 RAM이 필요한것이니.. ㅎㅎ assembly에 사용할 read 양이 적으면 상관없습니다.
다만 assembly에 사용할  read양이 많으면 대용량 RAM은 필수라는 것 잊지마시기 바랍니다.
-RAM이 작아도 작동은 하지만 swap을 사용하므로 결과 보시기 힘드실겁니다. ㅋ

곰팡이를 assembly 해본 경험으로 미루어 Velvet 에서의 RAM 요구량을
대략 적어봤습니다.

Total Input (Giga)	Memory (Giga)
40	256
20	128
10	64
5	32
2	16
1	8

Velvet으로 assembly할때는 일단 RAM은 많으면 많을 수록 좋습니다. :) ㅎㅎ

그럼 오늘 포스팅은 여기까지 ㅋ

Tophat을 run할 때의 마음가짐

RNA-Seq 작업을 하면서 빈번하게 사용하는 Alignment tool로 TopHat을 꼽을 수 있다.
(나의 경우 그렇다. 아니면 말고.. 쳇~)

본인의 경우 대부분의 프로그램들의 default값을 사용하기 좋아라 하지만
최근 NGS관련 tool을 다루면서부터 default값은 신뢰하지 않기로 했다.
왜냐?

최근 각광받는 NGS 분석 tool들의 대부분의 default값들은 Human, Mouse같은 Model 종들에 대해서 적합한 것 들이지 내가 다루는 곰팡이나 식물은 전혀 Out of 안중이기 때문이다.

그래서 아주 죽을맛이다라는거다 ㅋㅋ
성능 짱 좋은 서버로 테스트 해보고 싶은 경우의 수를 모두 다 해보면 좋겠지만
논문내는건 시간싸움이다 보니 해보고 싶은 모든 경우에 대해서 테스트 못할 수 도 있다.

그래서 옵션 중에서 Key가 될만한 옵션들만 본인의 종에 맞게 조정해서 분석을 해야 그나마 시간 대비 분석 결과에 만족 할 수 있을 것으로 생각한다.

그 중 TopHat의 경우 intron-length를 분석하고자 하는 종에 맞춰서 값을 사용하기 바라는 바이다.
TopHat의 --max-intron-length의 경우 500,000bp인데 상식적으로 곰팡이 같은 종의 경우 한 유전자안에 500kbp짜리 intron이 있을리 만무하지 않겠는가?

그래서 이런 종 특이적인 정보를 사용하는 경우 본인이 분석하는 종을 대표할 수 있는 값을 사용하는 것이 보다 좋은 결과를 얻을 수 있을것이다.
(강릉 교육에서 들어서 요건 확인하고 한다는거.. ㅋㅋ)

사람이나 마우스 하는 분들은 걍 default 값 사용하면됩니다. (요건 좀 부럽습네다. ㅎㅎ)

아... intron길이 구하는건 스스로, 그걸 누가 매번 알려줄수는 없잖아~
구글링하면 어느정도 커버 할수 있을 자료 찾을 수 있습니다.
요즘 NGS때문에 denovo도 꽤나 하는듯 하니..
-대신 없으면 추가로 denovo하시면 될듯... 전략만 잘 짜면... 괜찮을듯한데.. ㅎㅎ


그래서 NGS 작업을 위해선..
스크립트언어라도 배우는게 좋다는 점~
간단한 코드는 짤 수 있어야 한다는 점~
텍스트 파싱은 할 줄 알아야 한다는 점~

Tophat2에서 libz.so.1 에러에 대처하는 우리들의 자세

RNA-Seq 작업을 하시는 분들의 경우
많은 분들께서 TopHat과 Cufflinks 조합으로 분석을 진행하리라 생각합니다.

본 글은 좀 old한 리눅스 시스템에서
TopHat 그것도 TopHat2의 바이너리를 사용하여 작업을 하실 때
libz.so.1 관련 에러가 나는 문제가 발생했을 때 대응 할 수 있게 해줍니다.
(경험치 +1)

기존 시스템에서 사용하고 있는 libz.so.1의 버전이 옛날것이라
이미 컴파일 되어 있는 Tophat의 바이너리파일에 저장되어 있는 정보랑 맞지 않아
발생 하는 것으로 보입니다.
fc12에서 TopHat-1.4.0에서는 전혀 문제가 없었는데..
fc12에서 TopHat2에서는 문제가 발생해버렸네요.
(그리고 fc14에서는 문제가 발생하지 않습니다.)

그러므로 다른 에러는 저도 모르겠습니다. ㅋ

/lib64/libz.so.1: no version information available

위의 에러를 만나시게 된다면
다음 링크에 있는 파일(fc14의 파일입니다.)을
리눅스의 /lib64/폴더 밑에 다운로드 받아 저장하시고,
링크를 새로 만들어 주시면 됩니다. :)


파일 다운로드 libz.so.1.2.5

원래 시스템에 있는 libz.so.1 링크는 삭제

>ln -s /lib64/libz.1.2.5 /lib64/libz.so.1

이렇게 하면 다음부터는 위의 libz.so.1 에러는 발생하지 않을 것입니다. :)

Good luck.