누가누가 미생물 프로파일링을 잘할까?

NGS가 태동된지 20여년.... (너무 과했나?) 대중적으로 관심을 받아 쓰는지는 10여년이 훌쩍 지나가고 있는 시점에 예전에는 454나 Solexa 정도 만져보던 시절에서 지금은 다양한 시퀀서들이 나와서 연구자들의 다양한 궁금증을 일선에서 해결해 주고있습죠 :)

여튼 그래서 21년 기준에 보편적으로 또는 미래에 대세가될 시퀀서들을 대상으로
누구나 관심있어하는 장내 미생물 프로파일링을 어느어느 시퀀싱 플랫폼이 잘하나 비교해보는 논문이 있어서 가져와봤습니다.

제목은 Comparison of 16S rRNA Gene Based Microbial Profiling Using Five Next-Generation Sequencers and Various Primers 이고,

doi: 10.3389/fmicb.2021.715500 입니다.

(물론 저자중에 제가 아는 분이 있어서 그런것은 아니고요, 구글링 하다가 찾아진겁니다.)

그래서 비교해볼 시퀀서는

MiSeq, IonTorrent, MGIseq-2000, Sequel II 그리고 MinION 까지.. ..
짧은 read와 긴 read들을 생산하는 대표 시퀀서들을 5개를 가지고 테스트를 해봤습니다.

시퀀싱을 잘 했는지 못했는지 확인하려면 시료의 정답을 미리 알고 있어야 겠죠?

그래서 한국 식약처에 등재된 19종의 미생물 종중에 8종을 선별하여서 다양한 비율의 Mock community를 만들어서 테스트 했다고 합니다. 

그런데 Mock community내에 미생물들의 비율은 어떻게 확인했냐!!
digital PCR을 사용해서 Mock community내 미생물들을 정량해서 확인했다고 합니다. 물론 Sequins (스팽글?, aka Sequencing spike-ins)이라는 방법을 활용할 수 있다고 하는데 다양한 박테리아에 대해서 모두 Sequins를 만들기 어렵기 때문에.. 이방법을 사용했다고 합니다. 사실어떤 방법이 golden standard인지는 모르겠으나 연구 디자인에 적합하면 되지 않을까 합니다.

여튼 8개 Mock community를 제작하였고, 각각에 시료를 바탕으로 5개의 시퀀서로 시퀀싱을 진행하였습니다. 그리고 분석은 MOTHUR을 사용해서 진행하였다고 합니다.

그럼 결론은 몬데?
뭣이 중헌디?

음... 개인적으로는 16S rRNA 서열을 한번에 확인 할 수 있는 롱리드 플랫폼이 숏리드 플랫폼보다 편향이 적다라는 결과를 기대했으나.. 도리어 숏리드 플랫폼에 비해서 롱리드가 더 편향적(과대 또는 과소 표현)이었다는... 물론 이게 긴 길이의 리드를 시퀀싱하기 위해서 전처리로 PCR단계에서 비롯된거 같다는 의견이었습니다만, Sequel II같은 경우 숏리드 플랫폼과 유사한 양의 결과물을 확인하기 위해서는 더 많은 비용이 소요될텐데... 그럼 롱리드 플랫폼을 사용할 이유가 딱히 없다는게 문제가 될듯합니다.

Figure 3,4,5를 잘 뜯어보면 

Bifidobacterium breve의 경우 숏리드 플랫폼에서 상대적으로 과소 표현되고,
Limosilactobacillus fermentum의 경우 롱리드 플랫폼에서 과소표현되고, 반대로 Lactococcus lactis subsp. lactis의 경우 롱리드에서 과대표현 되고,
Lactobacillus acidophilus의 경우는 플랫폼 상관없이 과소표현 되기도하고..

함께 있는 종에 따라 영향을 받기도, 받지 않기도 하기 때문에 해석을 할 때 고려해야할게 한두가지가 아니라서 좀 어렵죠. ㅎㅎ 

그리고 숏리드의 경우 가장 큰 문제점이 한정된 영역(V3-V4)의 서열만 가지고 확인하다보니 서로 다른 균주로 분류되는 문제가 있었고 이는 보통 probiotic bacteria인 Lactobacillus casei group(LCG)에서 확인되어서 LCG, probiotic bacteria 분석에는 V3-V4는 좀 피해야할듯 합니다.

결론은 연구에 맞게 적절하게 잘 사용하고, 직접 실험하지 않는 저같은 게으름뱅이들에게는 이리저리 분석할때 표준 데이터로 사용할만한 좋은 데이터가 확보되었다는 것입니다. :)

출처: @ye._.vely618

NCBI에서 제공하는 ribosomal RNA Database

때는 바야흐로 2020년 초

NCBI에 Blog에 새로운 ribosomal RNA 데이터베이스가 출시되었다는 글이 하나 떴었네요...

사실 그 전부터 BLAST용 ribosomal RNA 서열은 제공하고 있었습니다.

다만 그 전까지는 NCBI에 수집된 nucleotide 서열을 모아놓은 수준이었던것 같은데,

2020년에 공개된 데이터는 단순히 모아놓는 부정확한 정보 수준이 아닌 각 서열을 정확하게 식별하고 분류할 수 있도록 엄선하였다고 하네요 

rRNA뿐만 아니라 ITS 서열까지.. 2020년즈음에는 microbiome에 이어 mycobiota도 관심이 증가하고 있었던 시기였던터라 이전에 ITS 서열을 제공하지 않았던것 같은데, 역시 NCBI 훃님들은 페달 밟으면 아주 시원하게 뽑아주는듯 합니다.

여튼 요즘에는 16S, 18S, ITS 서열들을 잘 정리해서 식별할 수 있도록 (aka taxonomy 정보가 잘 정리되어 있다는 것이겠죠) 제공하고 있습니다.

>여기< 에 우리가 알고 있는 nt db와 nr db 말고도 다양한 local용 blast database들이 제공되고 있으니 잘 다운로드 받아 잘 사용하면 좋을 것 같습니다. 

또 유익한 정보를 가지고 블로그에 글을 적어보도록 하겠습니다. 

출처: @ye._.vely618

SAM-TB, 주인공은 나야나

결핵은 참 끊임없이 인류를 괴롭혀오는 감염병균 하나입니다.
더구나 이 녀석이 악랄한 이유는 누구에게나 동일하게 감염되는것이 아닌 개발도상국이나 저소득구간에 있는 생활환경이 그리 좋지 않은 나라나 가정에 더 잘 발병한다는 것입니다.

선진국, 다른 말로 고소득국가나 생활환경이 더 나은 곳에서 사는 사람들에게는 감염되지는 않지만 그래도 전세계가 관심있게 모니터링하고 있는 감염균중 하나일겁니다.

그래서인지 분석 Tool들이 생각보다 많이 나와있습니다.

물론 대부분 파편화되어 있었으나 최근들어 포괄적인 분석 tool들이 등장하고 있습니다.

오늘 소개하는 tool도, 이거 하나만 있어봐!!

다 할 수 있어 되겠습니다.

SAM-TB: a whole genome sequencing data analysis website for detection of Mycobacterium tuberculosis drug resistance and transmission

doi: 10.1093/bib/bbac030

이 분석 tool은 결핵균의 WGS한 데이터를 분석하는 tool이고, 약물 내성과 spoligotyping 및 NTM이라면 어떤 NTM 종인지도 구분할 수 있다. 즉 SAM-TB 하나면 결핵에 관련된 모든것을 다 확인 할 수 있습니다. 되겠습니다.

기존에 나왔었던 다양한 MTB 분석 tool들(KvarQ, PhyResSE, TGS-TB, CASTB, Mykrobe, TBProfiler, MTBseq 및 ReSeqTB-UVP)을 언급하면서 우리는 지금까지 나왔던 모든 분석 프로그램의 기능을 구현하고 있다라고 자랑하고 있고, 그런 tool을 웹에서 분석 해보실 수 있습니다. 라고 자랑하고 있습니다.

어디서? 바로 >여기<에서!!

근데 안타깝게도 오늘 (2023년 8월 29일 기준) 접속이 안되더라구요.

내일은 되길 바라겠습니다.

일단 다시 한번 중요 포인트를 짚어보자면,

MTB WGS 데이터를 사용하여
 약물 내성 변이 확인, 
 spoligotyping 확인,
 MTBC 및 NTM 확인
을 웹상에 업로드하여 분석 할 수 있다 되겠습니다만 가장 중요한 분석 사이트가 접속이 안되네요

여튼 기존에 1%씩 부족했던 기능을 가지고 있던 tool을 한 자리에 모아놨다가 가장 큰 의의일것 같습니다. 

생각보다 특이할만한 tool은 사용하지 않았고, 일반적인 NGS 분석을 해보셨다면 다뤄봤을 그런 tool들로 잘 구현했습니다.

BWA-MEM, samtools, VarScan, Kraken2와 각종 in-house script들...

사실 중요한게 약물 내성 변이의 db와 lineage, MTBC 및 NTM을 확인 할 수 있는 정보에 대한 내용이 더 잘 설명되어 있으면 좋았을텐데 그 내용은 살짝 빠져있는게 아쉬웠네요 

작년 초에 출판되었는데 벌써 웹사이트가 막히다니.. 

살짝 아쉬움을 남기고 오늘 글은 마무리하도록 하겠습니다. 

@ye._.vely618

SpeedSeq은 어디에 쓰는거지?

오늘은 연식은 좀 되었으나 빠른 분석 tool하나 가져와봤습니다.


SpeedSeq: ultra-fast personal genome analysis and interpretation

doi : 10.1038/nmeth.3505

이름하여 SpeedSeq!! 그래서 제목에 ultra-fast, 초고속이 들어갑니다.
근데... 분석시간이 얼마나 걸렸었는지는.. 기억이 잘..

논문에서는 저렴한 서버에서 50x WGS데이터를 13시간만에 align을 했다고하는데...
(저렴한서버의 정의는 CPU 16core에 128GB RAM이 장착된 서버라고 하네요)

여튼 논문에서는 50x WGS 데이터를 저렴한 서버를 사용해서 분석을 진행할 때 정렬 작업을 시간단위에서 끝냈다.. 라는 소식을 솔직히 DRAGEN 제외하고서는 들어본적이 없어서 조금 갸우뚱 하긴 합니다.

여하튼 논문에서 13시간만에 정렬을 끝냈다고 했다니!! 그렇다고 믿는게 인지상정 아니겠습니까?

근데 정렬 속도가 빠른건 큰 장점이지만 단순히 속도만 빠르면... 그건 아무짝에도 쓸모없는거죠

그래서 SpeedSeq와 기라성같은 변이 탐지 툴들과도 비교 해봤습니다.

somatic/germline 분석 툴들을 가리지 않고 모두 비교해봤습니다. GATK의 Haplotype Caller, Mutect, VarScan2와 같은... 기존에 너님들이 많이 쓰던 툴들이랑 비교해서 결과 다르지 않아. 라고 얘기하고 있습니다.

그런데 사실 저는 SpeedSeq을 사용한 이유가 속도가 빠르면서 bwa와 같은 기존 정렬 프로그램 대비 결과가 정확해서 사용한것이 아닌 그냥 LUMPY tool을 사용하기 위해서 였다는게 함정

사실 이 정렬 tool이 nature에 출판되었는지도 몰랐다는..

LUMPY사용하려고 메뉴얼보니 SpeedSeq 결과 사용하세요 라고 적혀 있어서 단지 사용 했었을뿐... 그 후에 나도 몰라 하고 있었는데...

그냥 한번 들쳐봤는데 다시 검토해볼만한 tool일거 같긴한데..

"Reference Sample 백만번 돌려서 결과 동일해요" 하는것보다 임상 샘플 10개만 분석해봐도 그 진가를 알아볼수 있으니...

만약에 제가 사용하게 된다면 다음에 다시 글하나 올려보도록 하죠 :)

출처: @ye._.vely618

누가 누가 Annotation을 잘 하나

작년에 나온 논문으로 NGS를 활용한 임상 유전체 판독 할 때 어떤 annotation tool을 쓰면 좋을지에 대한 내용입니다.

A performance evaluation study: Variant annotation tools - the enigma of clinical next generation sequencing (NGS) based genetic testing

doi: 10.1016/j.jpi.2022.100130

현재 다양한 annotation tool이 사용되고 있긴 하나 그 중에서 Alamut, ANNOVAR, VEP 3개 tool을 벤치마킹 해봤다고 합니다.

VEP는 Ensembl Variant Effect Predictor이고,
Alamut는 SOPHiA GENETICS에서 제공하고 있는 tool,
ANNOVAR은 qiagen에서 제공하고 있는 tool로 3개 tool 모두 annotation해봤다고 해봤으면 한번쯤 구경은 해봤을 tool 일겁니다.

결과를 얘기하자면 이 3개 tool을 이전에 확인되었던 298개 변이를 대상으로 벤치마킹하였고 이 중에서 VEP가 가장 성능이 좋았고, ANNOVAR이 가장 낮을 일치율을 보여주었다고 합니다. (298개 중 20개가 불일치하여 93.3%의 일치율)

그래서 Lurie Molecular Diagnostics Laboratory(저자들의 소속 기관)은 VEP를 사용하기로 하였다고 논문에 언급하긴 했는데 진짜 VEP를 사용하고 있는지 ANNOVAR나 Alamut를 몰래 사용하고 안하는지는 제가 알 방법이 없네요

여튼 NGS의 발달로 말미암아 WGS를 하면 400만개, WES를 하면 ~2만개 정도의 변이들을 탐지할 수 있게 되었죠. 그래서 이전에는 변이를 하나하나 탐지하는게 병목점이었다면 이제는 탐지된 변이를 정확하게 판독 할 수 있도록 annotation을 하는 것이 더 중요하고 병목점이 되었다는 것은 누구나 부인하지 못할 것입니다.

- 물론 최근에는 AI/머신러닝의 발달로 annotation 단계에서도 괄목할만한 신속 정확한 결과를 바라볼 수 있지 않을까 합니다. -

이런 이유로 Lurie Molecular Diagnostics Laboratory에서도 이전에는 Alamut를 사용하고 있었는데 라이센스 문제등 효율적인 문제가 부각되어 상용 tool들과 오픈 소스인 VEP간의 annotation 결과 일치도 테스트를 해보게 되었다고 합니다.

그렇다면 비교를 하기위해서는 정답이 있는 문제지가 있어야 되겠죠?
그래서 이전에 Lurie Molecular Diagnostics Laboratory에서 진행되고 큐레이션 되었던 191개 유전자에 있는 298개 변이를 테스트 세트로 했다고합니다.

3개의 annotation tools을 비교하기 위한 vcf를 준비해서 각각 분석을 진행하였다고 합니다.

그래서 확인한 결과 298개 중 278개 변이는 3개 tool에서 모두 동일하게 확인되었고, 그 중 VEP와 Alamut는 99% 일치 하였으나, ANNOVAR의 경우 20개가 불일치 하였다고 합니다. 298개 중 278개 변이가 3개 tools에서 동일하게 나온 이유가 ANNOVAR가 제대로 분석을 하지 못해서였네요.. 

VEP는 298개중 297개를, Alamut는 298개중 296개를 올바르게 annotation을 하였고, ANNOVAR은 위에서 언급한대로 278개만 올바르게 annotation을 하였다고 합니다.

조만간 누군가 고도화된 AI/머신러닝을 탑재한 annotation tool을 출시하면 새바람이 불지 않을까합니다.

그때까지 밥벌이는 해보는걸로 :)

출처: @ye._.vely618