일요일, 2월 19, 2023

언제나 인간이 선을 넘었지, 바이러스가 선을 넘진 않았지

지난 2월 16일 Genomeweb와 cell지에 무시무시한 뉴스 한편이...

말레이 천산갑에서 HKU4-CoV보다 더 넓은 숙주를 감염시킬 수 있는 MjHKU4r-Cov라는 새로운 MERS와 유사한 CoV가 있다는 것이 확인되었다고 합니다.

ㅎㄷㄷㄷㄷ 

GenomeWeb 기사는 제가 회원이 아니라 모르겠고 공개되어 있는 cell의 논문이나 가볍게 읽어 보았습니다.

"A bat MERS-like coronavirus circulates in pangolins and utilizes human DPP4 and host proteases for cell entry"의 논문으로, 모든 면에서 "가볍"게 읽었습니다. (진지하게 받아들이셔도 개취 존중)


일단 또 Pangolin, 천산갑이 등장했습니다. 
천산갑이 매개자 역할을 하는 것인지 명확하지 않지만(저말고 이 곰국저자 曰) 포유류중 가장 많이 밀매된다고 코로나로는 부족했나 봅니다.

여튼 맛이 좋은건지, 한약재로 인기가 좋은건지 모르겠지만 Malayan pangolins, 말레이 천산갑에서 새로운 MERS-like coronavirus (이하 MjHKU4r-CoV)를 86마리(이 말레이 천산갑은 어디서 구했는지 모르겠으나) 천산갑 중 4마리는 pan-CoV PCR 양성, 7마리는 혈청 양성 반응을 보였고, 시퀀싱을 하여서 4개의 바이러스 서열을 확보, 이중에서 MjHKU4r-CoV 서열도 함께 확보해서 이런저런 실험을 진행해보았다고 합니다.


그래서 천산갑에서 확인된 새로운 바이러스가 사람도 감염시킬 수 있는가?

MjHKU4r-CoV는 사람을 감염시킬 수 있는가? 어려운 실험얘기는 논문 보시면 알 수 있고, HKU4-CoV, MERS-CoV, MjHKU4r-CoV를 가지고 실험을 해 보았다고 합니다.

근데 왜 MjHKU4r-CoV의 감염력 실험을 하는데 다른 2개 바이러스는 왜 할까? HKU4-CoV는 박쥐 코로나바이러스로 사람에게 직접 감염이 어려운 바이러스(음성컨트롤)이고, MERS는 MERS는 이미 사람에게 감염되는 것으로 알려져있죠(양성컨트롤)? 논문 제목과 새로운 바이러스의 이름때문에 박쥐(HKU)와 MERS를 비교삼아 진짜 감염력이 있는지 어느 녀석과 감염력이 유사한지 확인해본겁니다. 

그래서 결론은 사람 너님은 잘 감염됨. 또한 ACE2와 비슷한 hDPP4 또한 중요하다는 것도 확인했고 DPP4라는 수용체를 바탕으로 숙주가 가능한 것들을 한번 테스트 해봤는데.. 돼지, 염소, 고양이, 토끼, 말, 쥐, 햄스터, 개와 같이 감염시킬 수 있는 숙주의 범위가 꽤나 넓습니다.


근데 지난번에 우리 COVID19에 사용할 수 있는 치료제 있다고 하지 않았나?

예, 음.. 정확히 COVID19에 사용하기 위한 치료제는 모르겠고 에볼라 치료를 위해 만들었던 Remdesivir가 COVID19에도 효과가 있다고는 알려져 있어 사용해보았고 추가적으로 무엇인지는 모르겠으나 GC376, EIDD-2801라는 물질도 MjHKU4r-CoV에 효과가 있는지 확인해보았다고 합니다.

다행히 바이러스의 복제를 억제하는 효과는 있는것으로보입니다(Fig 7).
다만 MjHKU4r-CoV와 함께 MERS는 했으면서 왜 SARS-CoV는 왜 안했지.. 조금 궁금하네요..
그리고 억제 효과가 1uM이하에서는 안보이기 시작하는데.. 실제 주사로 투여했을 때 1uM이라는 수준으로 약제가 잘 도착해야할텐데... 


무튼... 

연구의 한계점이 있다는 것을 밝히면서 마무리하고 있는데, 삼림채벌이나 야생동물의 무분별하게(비위생적으로) 거래되어 애초에 인간과 접촉할 일이 없었던 바이러스들이 인간과 많이 접촉하게 되어 문제가 되고 있으니 적극적인 감시와 모니터링이 필요하다고하면서 논문을 마무리하였습니다.


천산갑에서 또 다른 COVID19와 유사한 바이러스가 또 나와서 COVID19와 같은 피해와 슬픔을 또 줄 수 있으니 두려움이 생길 수 있으나 아직은 가능성에 대한 내용일 뿐 지금부터 잘 대처하고 준비하면 COVID19 때 보다는 나은 상황이 펼쳐지지 않을까 하는 기대를 가져봅니다.



출처 : @ye._.vely618


월요일, 2월 06, 2023

우리들의 Nanopore는 결핵균을 잘 시퀀싱하여 세계 공중 보건에 기여할 수 있을까?

Evaluation of Nanopore sequencing for Mycobacterium tuberculosis drug susceptibility testing and outbreak investigation: a genomic analysis

https://doi.org/10.1016/S2666-5247(22)00301-9 


그래서 한번 알아 보았습니다.

일루미나 일색인 시퀀싱 시장에 신성처럼 찾아온 (찾아왔지 떨어지지 않았습니다.) long-read sequencing의 이단아 ONT을 사용한 결핵균의 drug susceptibility testing (DST) 결과가 기존 일루미나 결과에 비해 부족하지 않고, 동등한 결과와 정보를 제공해 줄 수 있는지 확인해 보았습니다.


영국, 남아프리카등의 샘플을 MiSeq, HiSeq, NextSeq, MinION, GridION, PacBio 기기를 사용하여 시퀀싱 진행하였습니다. 물론 개별 시퀀서마다 동일한 샘플을 시퀀싱한 것은 아니고 영국샘플은 MiSeq, GridION에서, 남아프리카나 마다가스카르 샘플은 HiSeq, NextSeq, MinION에서 진행하였으나, 전체적으로 short와 long read 시퀀서간에 비교 할 수 있도록 디자인은 되었습니다.

일루미나는 UK에서 사용하는 COMPASS를 사용해서, Nanopore는 BCFtools를 사용하여 변이를 확인하였습니다.

그래서 일루미나와 Nanopore의 변이 결과를 확인해보니(본문의 figure1을 참고) 재현율이 다소 떨어지는 경향을 확인 할 수 있었습니다. 

Nanopore는 정밀도: 99.3%, 재현율: 90.2%

일루미나는 정밀도: 99.6%, 재현율: 91.9%

그리고 151개의 isolate(시퀀싱한 isolate는 208개이나 일루미나와 Nanopore를 동시에 비교 할 수 있는 데이터는 151개 였음)에서 66,537개의 저항성 변이가 call되었는데 일루미나와 Nanopore간에 4개의 차이밖에 보이지 않았다고 합니다. (이정도면 거의 동일한 수준 아닌가?)

그래서 결론은 우리 모두 예상하듯이 Nanopore 데이터로도 정밀한 변이 call이 가능함을 확인하였고, 그 결과 또한 일루미나와 동등한 수준이므로, 깨작 깨작 하지 말고 Nanopore를 이용해서 MTB 전체 서열을 한번에 분석해서 결과를 주면 좋지 않을까 기대하고 싶다. 되지 안하을까합니다.


본 저자는 ONT.L 주식을 (아직) 보유하고 있지 않습니다.










월요일, 7월 25, 2022

mummer에서 larger than maximal textlen에러가 발생한다면

MUMmer3를 사용해서 작업하다가 

textlen에러를 맞이할 경우가 사실 생각보다 많이 있으리라고는 생각하지 않지만

그래도 이런 문제가 발생하였을 때 어떻게 대체해야 하는지

이미 수년전에 어느 용자께서 이에 대한 해답을 정리하셨었습니다.!!

>여기<


한글로 풀어쓰자면

1. MUMmer3.23/src/kurtz/libbasedir/types.h에 "#define SIXTYFOURBITS” 행을 “#ifdef SIXTYFOURBITS"이 행앞에 추가 하기

#define SIXTYFOURBITS
#ifdef SIXTYFOURBITS


2. 그리고 make할때 다음과 같이 하기

make clean

make CPPFLAGS=”-O3 -DSIXTYFOURBITS”



그럼 마법과 같이 MUMmer3 구동시 에러가 발생하지 않습니다.



출처 : @ye._.vely618




수요일, 7월 20, 2022

Long Read 조립은 누가누가 잘하나

Piroplasm를 나노포어를 사용하여 genome project를 진행했고 나노포어를 활용한 assembler들에 대한 성능 비교 논문 되겠습니다.


제목은 Systematic Comparison of the Performances of De Novo Genome Assemblers for Oxford Nanopore Technology Reads From Piroplasm

doi는 https://doi.org/10.3389/fcimb.2021.696669


piroplasm이 몬지는 모르겠으나 일단 그렇게 엄청나게 복잡하지는 않은 원생동물이나 사람이나 동물들에게 질병을 일으키는 녀석 되는 것 같습니다. funding중에 동물 전염병 및 인수공통전염병 관련 프로그램이 있는것으로 보아하니...


여튼 중요한건 nanopore로 읽어낸 서열을 사용하여 genome 조립할때 어떤 어떤 조립 프로그램이 제일 좋은지를 검토해본 것이니 OLC (Over-Layout-Consensus)나 전통적인 de-Brujin graph, string graph-based 방법 등등의 NECAT, Canu, wtdbg2, Miniasm, Smartdenovo, FlyeNextDenovo, Shasta와 같이 일반적으로 long-read에 사용하는 assembler들을 비교 테스트 하였다고 합니다.

대신 여기서는 assembly의 정확도와 함께 CPU 사용량, 메모리 사용량, 분석시간 사용방법 등등에 대해서도 함께 평가했다고 합니다. 참 바람직한 태도라고 봅니다. 모든 연구팀들이 그래픽카드 4개꼽히고 6T 메모리의 4U 서버를 가지고있는것은 아니니 말입니다.


실험 방법은 prioplasm free한 양 2마리(??)에게 prioplasm을 감염시켜 잘 배양(??)시킨 다음 Qiagen 사용 prep kit을 가지고 DNA 추출하고 PromethION으로 시퀀싱하였고 데이터 셋트에 따른 assembly 결과 평가를 위해 6가지 생산량 (약 15x, 30x, 50x, 70x, 100x, 120x)의 셋트를 만들었다고 합니다. 그리고 추가적(aka error correction)으로 (일루미나와 특허 소송에서 승리한) MGI로도 시퀀싱을 하였다고 합니다.


여튼 결과적으로

N50과 contig개수(적을수록 좋음)는 생산량과 밀접하고,
분석 시간은 생산량이 많으면 어떤 assembler를 사용하던 길어졌고,
polishing은 안하는것보다 하는것이 좋은것 같고 각 tool의 장단점은 Figure3에 방사형 그래프로 이쁘게 표현하였으니 한번 참고하시면 좋을것 같습니다.

그래서 Miniasm, Flye, wtdbg2는 그닥 좋은 선택지는 아닌것 같고 평균 커버리지가 30x 이상 확보된다면 NECAT, Canu, NextDenovo, Smartdenovo가 더 나은것 같다 정도 되겠습니다.

(사실 위의 tool들을 실행시키려면 평균 30x 이상은 있어야 작동을 합니다. 안그러면 작동안하던지 말도안되는 결과들을 뱉어내곤 합니다.)


그리고 시간이 충분했는지 각 assembler 결과들을 병합/후처리하는 작업을 하여 더 나은 assembly 결과를 보여주는지 테스트 했고 몇몇 조합에서 결과물이 향상된것을 확인했다는데... dramatically 좋은 결과는 보여주지 않은것 같았습니다. 

만약 병합/후처리하는 결과가 좋았다면 논문 결과가 single assembler 쓰지말고 ensemble방법을 추천드립니다라고 했었을테니 말이죠.. 



출처: @candyz_hyojung


토요일, 6월 18, 2022

mummer4, 미처 알아보지 못했다

mummer는 서열 정열프로그램으로 꽤나 오래부터 사용되었던...
NGS시대에 접어들면서 일반적으로 사용되지는 않고...
Reference 제작할때 종종 쓰이는...

MUMmer이라고 보통 쓰는데... MUM의 의미가 "Maximal Unique Matches"라고.. 여기에 나와있었네요..

그리고 이번에 알았는데.. MUMmer는 당연히 target와 query는 fasta형식만 입력될줄 알았는데 input으로 fastq도 사용할 수 있다는..
당연히 fasta 형식으로 변경해서 사용하려고 했는데... 작동해서 잠깐 화장실좀 다녀왔다능..

input으로 fastq형식을 받을 수 있는 버전의 tools이 2018년도에 논문으로 출판되어 한번 들추어 보았습니다.

이름하여 MUMmer4: A fast and versatile genome alignment system

이전 MUMmer3 이후 데이터구조를 32bit에서 48bit로 증가시켜 이론적으로 비교가능한 크기가 141Tbp (다시 한번 화장실을 다녀오게 만드는.....)로 늘렸다는.. 근데 이거 141Tbp이 입력 파일이면 입력 파일 로딩하는데만 한세월 아닌가...

여튼..

MUMmer4 논문 작성 할때 언급해준 정렬 프로그램으로
그냥 생명정보학 분석한다고 할때 기본 옵션인 BWA/Bowtie,
PacBio 데이터 할때 사용하는 BLASR 들을 언급해 주셨는데
이제 fastq형식의 파일을 지원해서
reference vs reference 비교 프로그램이 NGS용 정렬 프로그램들에게 어깨를 나란히 할 수 있는 기회를...

mummer라고 하면 갱장한 legacy 프로그램이라고 생각할 수 있지만...
다방면으로 개선 시킨 mummer4를 하나하나 뜯어보면 갱장히 힙해졌다고 볼 수 있습니다.

NGS 시대에 다양하게 쏟아져 나오는 reference크기에 대응할 수 있도록 비교 사이즈의 증가(141Tb)되었고, 또한 긴 서열 작업시 메모리 문제가 발생할 것을 대비해서 긴 서열들을 자동으로 분할해서 작업해주는 --batch라는 옵션기능까지...

mummer4의 새로운 기능들이 갱장히 많아졌습니다.

reference 서열을 제작하는 de-novo assembly하시는 분들 외에도 다양한 작업시 사용할 수 있을것으로 생각되니 한번 기능들 구경해보시고 활용해보시기 바랍니다.


그런데... 사실 NGS 서열 정렬은 역시 여기가 맛집이긴 합니다.


ps. BLAST에서도 query파일을 fastq 형식을 받을 수 있다고 합니다. 이름하여 Magic-BLAST를 사용하시면되겠습니다. 속도는 잘 모르겠습니다. ㅎㅎ 


@ye._.vely618