Nextera DNA Flex는 모지?

이번글은 그냥 둘러보다가 알게된

일루미나에서 새로 나온듯한 Library Kit에 대해서 한번 알아보겠습니다.

모 나온지는 1-2년된듯한 라이브러리 Kit같습니다.

일루미나 라이브러리에 TruSeq이라는 라이브러리 킷외에 Nextera라는 라이브러리 킷이 하나더 있었다는건 나 좀 시퀀싱 읆어봤다 하시는 분이라면 다 알고 계실겁니다.

Nextera가 TruSeq과의 큰 차이점이라고 한다면 fragmentation과 tagging이 Transposome이라는 짜르고 붙이는 기능이 포함되어 있는 효소를 가지고 한다는 점일 겁니다.

지금까지 제가 알고 있었던 Transposome이 라는 녀석이 하단의 fig 2. 처럼 작동해서 fragmentation의 size가 broad하다는 것으로 알고 있었는데...

출처: Nextera DNA Library Prep Kits Data Sheet

그런데 최근 Nextera Library Kit에다가 재미있는 방법을 결합시켜서 이전보다 fragmentation과 tagging 작업을 더 효율적으로 바꾼것 같아보이네요

Bead-linked Transposome 바로 BLT 되겠습니다.

맛있겠다. 출처: 맥도널드 홈페이지

이게진짜 BLT 출처: 일루미나 홈페이지

Bead에 Transposome 를 붙여놓고 거기다가 DNA를 넣어서 슥하고 자르고
삭하고 PCR primer를 붙여버린다는...
물론 transposome의 단점은 그대로 가지고는 있다능
fragment size가 일정하지 않은데, 그리고 추가적으로 양쪽에 PCR primer가 각각 있어야되는데 그렇지 않은 애들은?
(그럼에도 불구하고 팔아먹고는 있네요.. ㅎㅎ )

그래도 이전 방법보다는 fragment size가 조금더 일정하게 나오지 않을까하는
그리고 사람 손은 한번은 덜 타니깐 조금은 나은 방법으로 발전하는게 아닌가 하고 생각은 드네요 ㅎㅎ

출처: @sana_twice.09

관련 자료

Nextera DNA Library Prep Kit Data Sheet

Nextera Infographic

Nextera DNA Flex

Bead-linked transposomes enable a normalization-free workflow for NGS library preparation (새로나온 라이브러리 킷의 일루미나논문입니다.)

유전체 3사 기업 재무재표 살펴보기

음... 사실 지금까지 제 블로그에서는
허구헌날 분석 관련 로그 기록 내용이 올라 왔었는데
(그나마 그것도 잘 안올라오죠?)

그래서 이번엔 그냥 유전체 기업들 재무재표를 한번 훑어보는 기회를 가져보고자 합니다.

지금 다니고 있는 업체를 비롯해서 다녔었던 업체들 등등 동종 업체의 재무재표를
한번 훑어 보려고 하는데 전문적인 내용은 기대하지 마세요

저도 잘 알고 있는건 아니고
걍 자본과 부채의 합이 자산이라는 것만 아는 중생이라 ㅋㅋ

마크로젠, 테라젠, 디엔에이링크 3사에 의 재무정보를 통일성있게
볼 수 있도록 엑셀로 한번 만들어 봤습니다.
모 재무정보는 공시정보에 모두 공개되어있으니 대단한 정보는 아니죠 ㅎㅎ

>재무정보<

음... 짧은 지식으로 비교 하자면
마크로젠과 테라젠의 유형자산이 생각보다 차이가 많이 안납니다 테라젠의 경우 우리가 알고 있는 테라젠-이텍스 바이오연구소만 있는게 아니라 제약이 있어서 공장이 있음에도 말이죠.. 마크로젠은 왜 유형자산이 높은건지... 말하지 않겠습니다. ㅎㅎ

마크로젠은 자산치고 무형자산이 다른 두 회사보다 생각보다 적습니다.
특허가 생각보다 없다고 생각하시면되겠습니다(아놔.. 이렇게 특허압박 들어오는건가.. ).

마크로젠과 테라젠의 경우 유동부채가 꽤 큰 금액이기는 하지만 전체 부채금액 대비해서 대략 60%, 그에 비해 디엔에이링크의 경우 전체 부채대비 유동부채가 90%에 육박하고 있다는게 좀 차이점이긴 하죠
그리고 유동부채가 자산대비 좀.....

그냥 한번 유전체 3사하면 그냥 (사적으로) 생각나는 회사들의
재무재표를 한번 훑어봤습니다.

출처: @sana_twice.09

qiime2 파헤치기

간만에 qiime2도 간만에 공부하려고 docs를 한번 읽어보는 겸해서 정리도 같이? :)

그럼 qiime2가 무엇이냐 우리 롭 훃님께서 만든 microbiome분석 파이프라인,
아니 파이프라인을 뛰어넘어 토탈 분석 패키지(?)이라고 할 수 있는 툴입죠.
*토탈패키지라고까지 얘기하는 이유는 qiime1을 사용해보신 분이라면 감동의 눈물이.. ㅋ

Core Concepts는...

qiime2는 qza, qzv와 같은 독자적인 파일 형식을 지원하고 있네요
qiime1에서는 듣도보지도 못한.. 개념이라서 처음에 artifacts라는 단어를 보고
artifacts는 제거해야 제맛아니겠슴까 했는데..  (   ' ')


일단 간단히 qiime2는 qiime1과 달리 지저분하게 파일을 만들지 않고 qza, qzv 두개의 파일로 관리를 시도 하고 있습니다.

qza는 텍스트 파일을 조금더 관리가 용이하도록 json이나 table 형식으로 만든것 같고
qzv는 시각화 파일로 plot이나 그래프를 나름에 규격에 맞게 qza파일과 같이 구조화된 형식으로 만들어놓고 시각화하기 편리하도록 구현해 놓았다고 보면 될것 같습니다.
https://view.qiime2.org라는 사이트를 운영해서 qzv파일만 있으면 언제든지 확인 할 수 있도록 만든것 보면 예상 가능하죠. 어느 멍청한 놈이 만들어도 우리 사이트에 qzv파일 올리면 내용 볼수 있게 우리가 만들었어 라고 하고 있죠.

그래서 qiime2 처음 나왔을때 상용화하려고 하려나 하는 생각을 했음죠
예전에는 그냥 순수 bio업자들에게 친숙하지 않은 plain txt파일이나 csv파일만
디립다 생성하고 있는데 파일 내용을 굳이 보여주지 않지만
웹페이지에 파일 가져다 놓으면 이쁜 그림이 뙇!!

두번째로 공식적으로 plugin을 사용하여 확장성을... (이것 또한 상용화의 냄새가...)
잡았다고 얘기하고 싶겠지만... 일단 제가 qiime2를 한번도 안써봐서
모 내머리에서 번뜩 생각나는 것들인 이미 plugin으로 만들어놨을듯한..
어차피 루틴하게 쓸만한 plugin은 이미 다 있을테니 가져다가 사용하면 될듯 합니다.
plugin개발하고 싶으시면 >> 여기로 (전 너님이 개발하면 유용하게 쓰겠습니다. ㅎㅎ )

모 처음으로 qiime2 첫 페이지를 읽어 보았습니다.

다음에는 install qiime2를 해보고 싶은데..
사용할수 있는 서버가 닫혀있어서...
테스트를 해볼 수가 없네요 ㅎㅎ :)

여튼 사적으로 접근 가능한 서버가 열리면 한번 테스트해서 자세한 리뷰한번 해보는걸로 :)

ps. 이제 고대 유물이 된 qiime1 base로 만든 파이프라인은 어디에 팔아먹나...

출처: SM

간만에 de novo RNA-Seq 해보기 -조립편-

Trinity를 사용한 de novo RNA-seq은 별거없습니다.

다음과 같은 명령어를 사용하면 끝!

기본 Assembly 방법:

$ ~/trinityrnaseq-Trinity-v2.6.6/Trinity --seqType fq --max_memory <memory_size> --samples_file <sample.txt> --SS_lib_type <library type> --CPU <thread_num> --full_cleanup

$ ~/trinityrnaseq-Trinity-v2.6.6/Trinity --seqType fq --max_memory <memory_size> --left <left.fq.gz> --right <right.fq.gz> --SS_lib_type <library type> --CPU <thread_num> --full_cleanup

Genome Guide Assembly 방법:

$ ~/trinityrnaseq-Trinity-v2.6.6/Trinity --seqType fq --max_memory <memory_size> --samples_file <sample.txt> --SS_lib_type <library type> --CPU <thread_num> --genome_guided_bam <align.bam> --genome_guided_max_intron <max_intron> --full_cleanup

유경험자면 아시겠지만 RNA-Seq 데이터만 있으면 걍 default assembly방법을 사용하시는게 제일 좋은 결과를 얻으실 수 있으실겁니다.
어설프지만 genome 데이터가 있는데 그냥 하는것 보다 어설프더라도 genome을 활용하는게 좋지 않을까? 응 하지 마세요
어설픈 input은 어설픈 output을 너님의 손에 가져다 줍니다.

하실꺼면 Reference Genome 만드실때 genome을 탄탄하게 만들고 다양한 단계의 RNA-Seq을 하셔서 gene prediction할 때 RNA-Seq 데이터를 활용하세요
그게 맞는 방법입니다. :)

그리고 --SS_lib_type에 어떤 걸 넣어야 할지 난 모르겠다 하시는분은 여기 biostars를 참고하세요 :)

좀 더 자세한 wiki >여기<

출처: JYP

간만에 denovo RNA-Seq 해보기 -설치편-

최근 간만에 해보기가 올라가고 있는데...
진짜 2년만에 RNA-seq 분석을 해봐서..

걍 분석하는 단계나 프로그램 사용법 정리 차원에서 글을 올리고 있습니다.

4짜 산업 시대에 발맞춰 유전체 데이터 전문 설거지팀 하나 꾸리는것도 나쁘지 않을듯.... (대신 건당 비용때문에 수주가 안들어올 것 같다는게 함정 ㅎㅎ )

여튼 오늘은 de novo RNA-Seq 분석입니다.

일단 de novo RNAseq 시장을 석권했던.. 지금도 지배하고 있는 것으로 보이는데..
제가 사용했던 버전은 2.0.6이었는데.. ㄷㄷㄷ 벌써 2.8.4네요..
다들 아시는 삼위일체 Trinity 입니다.

지금 사용하는 서버에서는 cmake버전이 2.x라서 2.8.4대신 낮은 버전인 2.6.6버전으로 테스트를 수행하고 있습니다.
같은 input에 옵션이 비슷한데 2.6과 2.8의 결과가 많이 달라질지는 잘 모르겠습니다.
버전별 output 비교는 나중에 한번 기회되면 도전해보는것으로!!

$ wget https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/archive/Trinity-v2.6.6.tar.gz
$ tar zxf Trinity-v2.6.6.tar.gz
$ cd trinityrnaseq-Trinity-v2.6.6/
$ make && make install

참고로 make했을때 어쩌구 저쩌구 /usr/local/bin 권한없다라는 메세지를 보여주고 에러를 밷어낸다면 trinityrnaseq-Trinity-v2.6.6/util/support_scripts/ 밑에 있는 trinity_installer.py 파일의 destination_package_dir 변수명의 내용을 수정해주시면됩니다.
(제 경우 make할때 DESTDIR 설정을 해주어도 계속 /usr/local/bin을 요구해서... trinity_install.py 파일을 직접 수정했습니다. ㅎㅎ 다른 방법이 분명 있을거 같은데.. )

여튼 에러가 발생한다면 해당 에러를 잡고 설치하면(당연한 소리를..) 문제 없을것이라고 말씀드릴 수 있습니다!!

출처: SM 

간만에 RNAseq 분석 해보기 -Align-

이번 글은 Align하는 명령어 편! 되겠습니다.

HISAT2

$ ~/hisat2/hisat2 -p num_thread -x /path/to/reference_index --known-splicesite-infile /path/to/splicesite_file --tmo -1 /path/to/pair_1.fastq.gz -2 /path/to/pair_2.fastq.gz | samtools view -Sb - | samtools sort -m memory -@ num_thread - output.sortByCoord
혹은
$~/hisat2/hisat2 -p num_thread -x /path/to/reference_index --known-splicesite-infile /path/to/splicesite_file --dta
-1 /path/to/pair_1.fastq.gz -2 /path/to/pair_2.fastq.gz | samtools view -Sb - | samtools sort -m memory -@ num_thread - output.sortByCoord
혹은
$~/hisat2/hisat2 -p num_thread -x /path/to/reference_index --known-splicesite-infile /path/to/splicesite_file --dta-cufflinks -1 /path/to/pair_1.fastq.gz -2 /path/to/pair_2.fastq.gz | samtools view -Sb - | samtools sort -m memory -@ num_thread - output.sortByCoord

--tmo : Known transcript에 대해서만...

--dta : StringTie를 사용할 경우...

--dta-cufflinks : cufflinks를 사용할 경우...
인것같은 설명이 되어 있는 옵션입니다.

자세한 설명은 메뉴얼 사이트로... (일단 3가지 다 돌리는 걸로)

STAR

$ ~/STAR/STAR --runMode alignReads --genomeDir /path/to/reference_idx --runThreadN num_thread --outSAMtype BAM SortedByCoordinate --outWigType wiggle read1_5p --sjdbGTFfile /path/to/gtf --outBAMsortingThreadN num_thread --readFilesCommand gunzip -c --readFilesIn /path/to/pair_1.fq.gz /path/to/pair_2.fq.gz --outFileNamePrefix /path/to/output/prefix_ --quantMode TranscriptomeSAM --limitBAMsortRAM num_memory

자세한 설명을 원하시면 이곳으로!!

Kallisto

~/kallisto/kallisto quant -i reference_idx -o /path/to/output_dir --bias -t num_thread /path/to/pair_1.fq.gz /path/to/pair_2.fq.gz

Kallisto 메뉴얼은 여기로...


Salmon

~/salmon/salmon quant -i reference_idx -p num_thread -l A -o /path/to/output_dir --validateMappings --seqBias -1 /path/to/pair_1.fq.gz -2 /path/to/pair_2.fq.gz

보다 자세한 설명은 그곳으로..

Align에 필요한 명령어는 이정도면....  현재 명령어에는 각 tools에서 strand specific reads에 대한 옵션은 생략되어 있으니 library를 strand specific으로 했으면 해당 옵션을 활성화 하면됩니다. :) 저는 strand specific한 데이터가 아니라서... ㅎㅎ

출처: JYP

간만에 RNAseq 분석 해보기 -Reference편-

Alignment를 수행하기 위해서는 reference가 필요합니다.
모 어떤 alignment 툴에서는 그냥 genome 서열만 있어도 되지만
하이 쓰루풋 시퀀싱 데이터를 다룰 때는 대부분 genome 서열을
나름의 index를 새로 생성하게 됩니다.

앞에서 설치했던 aligner들의 index를 만드는 작업의 로그를 남겨보도록 하겠습니다.

BWA

$ ~/bwa/bwa index -p index_name genome.fa

hisat2

$ ~/hisat2/hisat2_extract_exons.py genome.gtf > genome.exon
$ ~/hisat2/hisat2_extract_splice_sites.py genome.gtf > genome.ss
$ ~/hisat2/hisat2-build -f genome.fa --ss genome.ss --exon genome.exon genome_index_base

STAR

$ ~/STAR/STAR --runThreadN 16 --runMode genomeGenerate --genomeDir genomeOutFolder --genomeFastaFiles genome.fa --genomeSAindexNbases index_base --sjdbGTFfile genome.gtf --sjdbOverhang 99

Kallisto

$ ~/tophat/gtf_to_fasta genome.gtf genome.fa genome.gtf2fa.fa
$ ~/kallisto/kallisto index --index=index_name genome.gtf2fa.fa

Salmon

$ ~/salmon/bin/salmon index -t genome.gtf2fa.fa -i genome_idx --type quasi -k 31

이렇게 하면 각 align tool을 사용하기 위한 reference는 준비되었습니다.

출처: SM

간만에 RNAseq 분석 해보기 -설치편-

근 몇년 만인가요..
간만에 RNAseq을 손에 뭍혀봅니다.!! :)

여러가지 Tool을 조합해서 일단 해보고 좋은 놈 골라 쓸 생각이라서
여러 aligner와 abundance tool을 사용할 예정입니다.
그래서 오늘은 서버에 설치된 프로그램 유무 확인 및 업데이트를 해봐야겠습니다. Orz

그래서 오늘 설치편되겠습니다.

오랜만에 작업하는것이라 잘 될지 모르겠습니다. ㅋ

사실 이건 그냥 스킵하셔도 됩니다.
그냥 제 작업 로그 남기는 거거든요 ㅎㅎ :)

bwa (https://github.com/lh3/bwa, 2019.02.27 기준 0.7.17)

$ git clone https://github.com/lh3/bwa.git
$ cd bwa
$ make

hisat2 (https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml, 2019.02.27 기준 2.1.0)

$ wget http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/dl/hisat2-2.1.0-Linux_x86_64.zip
$ unzip isat2-2.1.0-Linux_x86_64.zip

STAR (https://github.com/alexdobin/STAR, 때마침 2019.02.25일에 업데이트 ㄷㄷ)

$ wget https://github.com/alexdobin/STAR/archive/2.7.0e.tar.gz
$ tar -xzf 2.7.0e.tar.gz
$ cd STAR-2.7.0e

StringTie (https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/ 2019.02.27 기준 1.3.5)

$ wget http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/dl/stringtie-1.3.5.Linux_x86_64.tar.gz
$ tar zxf stringtie-1.3.5.Linux_x86_64.tar.gz
$ cd stringtie-1.3.5.Linux_x86_64

HT-Seq (https://github.com/simon-anders/htseq, 2019.02.27 기준 0.11.0)

$ pip install HTSeq

혹은

$ pip install 'HTSeq==0.11.0'

혹은

$ easy_install 'HTSeq==0.11.0'

잘 안되시면 주위에 리눅스에 HTSeq를 설치할 줄 아는 친구를 찾으십시요! :)

Kallisto (https://pachterlab.github.io/kallisto/, 2019.02.27 기준 0.45.0)

$ wget https://github.com/pachterlab/kallisto/releases/download/v0.45.0/kallisto_linux-v0.45.0.tar.gz
$ tar zxf kallisto_linux-v0.45.0.tar.gz
$ cd kallisto_linux-v0.45.0

Salmon (https://combine-lab.github.io/salmon/, 2019.03.04 기준 0.12.0)

$ wget https://github.com/COMBINE-lab/salmon/releases/download/v0.12.0/salmon-0.12.0_linux_x86_64.tar.gz
$ tar zxf salmon-0.12.0_linux_x86_64.tar.gz
$ cd salmon-0.12.0_linux_x86_64/bin

일단 설치는 여기까지,
옛날에는 컴파일하느라 설치가 반이었는데
요즘은 걍 컴파일이 잘 되어 있어서 ㅎㅎ :)

다음 포스팅은 reference 생성 내용입니다. ㅋ
-별거 없습니다. :)

출처: JYP

Microbiome Database를 만들어볼까? -ChunLab편-

간만에 Microbiome DB 관련 글을 올립니다!
그래봤자 또 다운로드하자 되겠습니다. :)

오늘은 국내 microbiom 기업중 가장 기술력을 가지고 있는
업체인 chunlab의 DB 되겠습니다.

이 DB의 경우 당연히 fee를 내셔야합니다.

라이센스를 정확히 안읽어봤는데..
비영리면 무료였나? 정확하진 않지만
무엇인가 영리 서비스 하고자 EzBioCloud 16S database를 사용하려면
fee를 내야합니다.

다운로드는 다음 링크에 가셔서 다운로드 받으시면 됩니다.

>이곳<

천랩의 DB의 경우 제가 사용하겠다 말겠다할수 있는건 아니라서..
다운로드 받고싶으신 분들만 받아서 잘 사용하시면 되겠습니다.
qiime으로 분석하시는 분들께서는 별 무리없이 사용하시는 파이프라인에 붙여서 사용하실 수 있게 제작되었습니다. 사실 그냥 작동합니다. :)

출처: SM

Circos를 그까이꺼 한번 해보자 -설치편-

몇년 전부터 Genome을 그린다면 염색체 모양이 아닌
죄다 동그랗게 그리게 한 장본인!!
바로 그녀석! Circos (발음은 나도몰라 그냥 부르고 싶은데로!!)

공식 사이트: http://circos.ca/

사실 circos는 NY Times와 같은 미언론의 인포그래픽의 한 축을 담당했었는데
지금은 나도 모르겠다능.. 여튼 그래서 circos가 기능은 막강하지만
그만큼 사용하기 까다로워서 동그안 genome은 그려주지만 비슷한 기능을 하는
간단한 프로그램들도 많이 나왔다능....
(그래서 결론은 꼭 circos를 사용해야 그릴 수 있는건 아니라는걸 먼저 밝혀둡니다.)

현재 버전은 0.69-6 랍니다.
제가 마지막에 사용했던 circos버전은 0.67-4라는건 비밀...

그래서 일단 다운받아서 실행해 보았습니다. 업데이트 되면서 몬가 더 필요로 하고 있는지..

$ wget http://circos.ca/distribution/circos-0.69-6.tgz
$ tar zxf circos-0.69-6.tgz
$ cd circos-0.69-6/bin
$ ./circos
하면 (정상적으로 perl들이 설치되어 있어도)에러 납니다.
$ ./circos -modules
하면 설치가 안되어 있는 모듈들을 보여줍니다.
시스템 perl이나 circos가 사용하려는 perl에 circos가 필요로 하는 모듈들을 설치해 주면됩니다. :)
circos 설치 방법을 참고하셔서 설치하시면됩니다.

출처: JYP