Microbiome Database를 만들어 볼까? -Silva편-

SILVA는 de.NBI 가 뒷배인 DB로 지속적으로
업데이트되고 있는 DB중 하나입니다.

서열 개수도 아마 가장 많을 것으로 생각됩니다.
대신에 그만큼 정리가 가장 안되어 있기도 합니다. ㅋ
-사실 이정도 양의 서열에 저정도 수준을 갖춰놓은것도 용하긴합니다.

그리고 작년? 제작년쯤에 SILVAngs라는 서비스
MG-RAST의 대항마쯤으로 런칭을 했는데 사견으로는
그때 이미 MG-RAST는 심심하면 서비스 다운되서 MG-RAST는
이미 논외 대상이었을것 같다능...(다년간 쌓아놓은 데이터가 문제였지..)

여튼 silva에서 제가 사용하고자 하는 파일은
silva에서 제공하는 qiime용 파일입니다.
>다운로드링크<

직접 찾아가려는 경우 [Download] > [Archive]를 클릭하시면
페이지에 온갖 리스트들이 나오는데 그중에서 [qiime]를 클릭하시면
제가 사용하고자 하는 파일이 보이실 겁니다. ;)

ㅋㅋ 당분간은 계속 다운로드만 주구장창 받는 글들입니다. :)

출처: JYP

SILVAngs

QIIME2이후 새로운 녀석이 나타났다!!

silvangs음.. 왠지 

MG-RAST 대항마로 나온듯

MG-RAST야 분석 파이프라인만 제공하는것에 반해

silvangs의 경우 막강한 16S rRNA DB를 탑재하고 있으니...

그리고 silvangs 뒤에는 de.NBI (German Network for Bioinformatics Infrastructure)가 든든히 버티고 있는중 좋은 피드백이면 반영해주지 않을까? 하는 생각이..

그리고 silvangs도 일단은 credit으로 운영중 가입하면 300k주고 시작하는데
과금 방법이 분석횟수인지 분석에 필요한 스텝기준인지 아직
안사용해봐서 잘 모르겠다능.. :)

여튼 단점은 rDNA용 커뮤니티 분석이라는것이 한계

WGS가 플랫폼으로 나오면 대박일듯...  물론 WGS이 나오기에는 아직
넘어야할 산이 좀 있으니...
불안불안한 MG-RAST에 이어 web 기반 분석 플랫폼이 나와준것에 박수를..

16S rRNA와 시퀀싱플랫폼

블로그에 쓰는 내용이 16S rRNA에 많이 집중되고 있긴하죠? ㅎㅎ
하는일이 이거다보니.. :)

여튼 오늘은 16S rRNA와 시퀀싱플랫폼에 대해서 잠시 이야기 하도록 하겠습니다.

최근 16S rRNA sequencing의 최강자 454가 서비스를 bye bye한 관계로
많은 연구자들이 MiSeq체제로 변환하고 있는데 (물론 Ion도 있고, PacBio도 있습니다.)
기존에 454를 사용했을 때와 다른 V region을 사용하고 다소 다른 결과들을 보이는 것들이
있을 것 입니다. 그래서 이리저리 검색하다가 걸린 논문 두 개를 가지고 잠시 얘기해보고자 합니다.

Nucl. Acids Res. (2010) 38 (22): e200.

PeerJ (2016) 4:e1869

논문을 찾아보기 시작한 이유는 454가 막을 내린 후 다른 시퀀싱 플랫폼에서는 왜 다른 region을 target하고 있고 왜 diversity에 차이를 보이는지... (내가 분석을 잘못했나.. ㅎㄷㄷㄷ)

우선 V region, 454는 V1-V2였는데 MiSeq은 V4 region을, Ion은 4개 region? 7개 region? 을 동시에target하고 있다는..

모 논문보면 아시겠지만
2010년 논문은 454 vs MiSeq을 비교했습니다. 두 플랫폼이 차이가 날까? 어떤것이 차이가 날까?

2010년도 논문을 한장 figure 요약하자면 이거죠

상단은 phylum abundance/ 하단은 genus abundance 그리고 좌측에 있는 V4는 이전 연구에서 사용되었던 기준이라고 생각되는 참고용 분포입니다. 실험 결과가 V4 region이 저 분포를 나타내면 실험이 잘됐다고 확인하는 용도로 사용됩니다.

사실 phylum은 크게 차이없죠, 차이가 있기도 쉽지않습니다.
관심사는 genus되겠습니다. 일루미나 데이터의 대부분은 unclassified입니다. 논문에서는 error때문에 이렇게 나왔으니 error좀 낮아지면 일루미나가 output이 많으니 sequence error 문제점을 개선된다면 미생물 분석에 적합한 킹왕짱 시퀀서가 될거라고 하는데 개인적인 생각으로는 sequence error(454가 일루미나가 한테 sequence error ㅋㅋ 좀 웃겼다능..
systematic error는 눈에 안뵈냐라고 한다면 눼눼, 하긴 이 논문이 2010년이란 것을 감안한다면 무리는 아니긴 합니다.)보다는 db선택이 unclassified문제는 보정할 수 있지 않을까 합니다.

그렇다면 이제 16s rRNA 입문한지 얼마안된 님께서 그렇게 느끼는 느낌적인 이유는
무엇인가?

바로 2016년 논문되겠습니다.

2016년 논문은 PacBio로 시퀀싱한 것을 db에 따라 분석 결과가 달라지는냐에 대한 내용으로
다음 한 장으로 요약 할 수 있겠습니다.




동일한 시료를 가지고 시퀀싱한 데이터를 16S rRNA db에 따라 classification되는 정도를 확인해본 그래프 입니다. 느낌 딹오시죠?
다만 나중에 뒤통수 맞았다는 느낌 안 받게 하나 말씀드리자면 RDP와 Silva의 경우 genus까지만 확인했고 gg는 genus와 genus+species 두가지로 확인한 것 입니다.

이제 PacBio의 Sequel에서 CCS로 생산된 16S rRNA 서열가지고 연구해도 나쁘지 않을 것 같다는..

아.. 이제 돈만 많으면 되는건가!!! 

rRNA database 간단 비교

근래 microbiome데이터를 다루면서
16s rRNA db 사용에 대해서 확인을 하고자
데이터가 꽤나 많은 그리고 non-academic의 경우 fee도 지불하는 silva를 qiime의 default db인 greengene과 한번 비교를 해봤습니다.

rdp말고 왜 silva를 비교했느냐?
rdp는 qiime에서 사용가능한 format으로 데이터를 제공안해서
그냥 테스트로 하는건데 format 변환하는거마저 신경을 쓰기에는
좀 귀찮아서 qiime용 format을 제공하는 silva를 사용하였습니다.

모 별거 없습니다. ㅋ

	GreenGene	Silva 119	Silva 123
Kindom	2	3	3
Phylum	90	95	113
Class	249	480	602
Order	405	1,468	1,686
Family	514	3,123	3,670
Genus	1,816	8,056	9,835
Species	1,651	31,337	42,974
Sum	99,322	173,838	251,764

위의 GreenGene는 qiime 설치시 함께 따라오는 기본 파일을 사용했고, silva는 silva측에서 qiime format으로 제공하는 데이터중 SSU 파일입니다.
리눅스에서 cut 명령어로 -d, -f 옵션을 사용해서 unique한것을 세어본것입니다.

GreenGene과 silva의 차이점은 GG는 archaea, bacteria만 있고, silva는 Eukaryota가 함께 있다는.. silva는 엄연히 따지자면 16s/18s를 모아놓은 것으로 생각하시면되겠습니다. :)

그리고 마지막에 Sum의 의미는 이 rRNA db를 이루는 classified/unclassified 되는 species(?)의 unique 개수입니다.
이 unique 개수가 많으면 좋을 것 같은 느낌이 본능적으로 딱 오죠?

근데 말입니다.

숫자가 크다고 다 좋은것일까요?

GG와 silva에서 큰 차이점이 GG의 경우 unclassified로 분류되는 항목은 딱 하나씩 포함되어 있습니다. (그 이유는 숙제~!!)
대신 silva에는 unclassified와 같은 부류인 아직 의미가 없는 즉 정보가 없는 항목들이 다수 포함되어 있다는것입니다. unclassified, uncultured, unknow....

무엇이 우월하다 좋다 말하기는 어렵습니다.
분석 툴에 따라 궁합이 맞는 db가 존재하기 마련이고 또 목적에 따라 db는 변화해야하기에
GG는 더 curation을 했으니 좋은것이다 혹은 silva가 더 seq정보가 많으니 좋은거다라는
것은 지양하고 결국 각자가 알아서 잘 사용하면 된다능.. :)